Notch信号通路与银屑病发病的关系及作用机制

狄伟

(山东中医药大学，济南271100)

Notch信号通路与银屑病发病的关系及作用机制

狄伟

(山东中医药大学，济南271100)

目的 探讨Notch信号通路与银屑病发病的关系及作用机制。方法 分别用RT-PCR、Western blotting技术检测30例银屑病患者皮损区皮肤组织(病例组)及其周边非皮损区皮肤组织(对照组)、30例正常人皮肤组织(正常组)中Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白表达；将人永生化角质形成细胞HaCaT随机分为Jagged1-Fc融合蛋白组、DAPT组、常规对照组，分别加入含Notch信号通路特异性激活剂(Jagged1-Fc融合蛋白，终浓度0、0.5、1、2 μg/mL)、Notch信号通路特异性阻断剂(DAPT，终浓度0、5、10、20 μmol/L)、常规细胞培养液干预24、48、72 h。用Western blotting法检测细胞内Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin蛋白表达，用MTT法检测HaCaT细胞增殖活力，用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 病例组Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相对表达量高于对照组与正常组(P均<0.05)。干预0、24、48、72 h，Jagged1-Fc融合蛋白组细胞增殖率随干预浓度升高依次升高，DAPT组随干预浓度降低依次降低(P均<0.05)。与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组细胞凋亡率降低、DAPT组升高(P均<0.05)。与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组Bcl-2蛋白相对表达量升高，Bax蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；DAPT组Bcl-2蛋白相对表达量降低，Bax蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组Keratin1及Involucrin蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；DAPT组Keratin1及Involucrin蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。结论 银屑病的发生与Notch信号通路的激活相关，其可能的作用机制为Notch信号通路促进角质形成细胞增殖、抑制其凋亡与分化。

银屑病；Notch信号通路；角质形成细胞；细胞增殖；细胞凋亡；细胞分化

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其主要病理特征为角质形成细胞过度增殖，导致表皮可凋亡的角质形成细胞异常分化，并伴随皮肤炎症浸润及血管生成异常等[1，2]。银屑病病程较长、易复发且较难治愈[3]。目前关于银屑病的发病原因和机制尚无定论，但普遍认为与遗传和环境相关[4]。Notch信号通路由多种分子及蛋白组成，参与多种疾病的发生过程，与银屑病的发生密切相关。目前研究较多的是Notch信号通路与免疫介导机制在银屑病发病中的作用[5]。角质形成细胞是构成表皮结构的主要细胞，约占表皮细胞总数的80%。多种皮肤肿瘤及炎症性皮肤病的发生与角质形成细胞增殖、凋亡、分化异常相关[6]。HaCaT细胞是从成人皮肤中分离的永生化角质形成细胞系，其遗传特性稳定，增殖、分化特性与角质形成细胞相似，在进行实验研究时常用来替代角质形成细胞[7]。2014年4月～2015年6月，本研究观察Notch信号通路关键因子在银屑病皮损区皮肤中的表达情况及对HaCaT细胞增殖、凋亡及分化的影响，探讨Notch信号通路在银屑病发病中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 皮肤组织标本来源 选择同期山东省中医院就诊的斑块型银屑病患者30例(病例组)，均经皮肤组织病理检查确诊。其中男18例、女12例，年龄18～75(32.6±7.4)岁。采集患者皮损区皮肤组织为病例组，同时采集距皮损区1 cm非皮损区皮肤组织作为对照组。纳入标准：皮损区近2周未外涂药物，近1个月未接受免疫抑制剂及其他药物治疗。排除标准：年龄<18岁或>75岁；合并皮肤肿瘤或其他增生性皮肤病；有心脑血管、肝、肾及造血系统等严重原发性疾病或其他情况不适合取材者。同期选取本院皮肤科留存的健康人皮肤组织样本30例作为正常组，健康人男16例、女14例，年龄18～69(34.2±6.8)岁。三组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。三组去除皮下结缔组织与皮下脂肪后，于液氮中速冻，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 细胞、试剂及仪器 人永生化角质形成细胞系HaCaT，购于中国科学院细胞库。Notch信号通路特异性激活剂(Jagged1-Fc融合蛋白)和Notch信号通路特异性阻断剂(DAPT)，购于美国R&D System公司；TRIzol、逆转录试剂盒、荧光定量试剂(SYBR Green I)，购于日本TaKaRa公司；Notch1、Jagged1、B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、角蛋白1(Keratin1)和重组人外皮蛋白(Involucrin)单克隆抗体，购于美国Abcam公司；辣根过氧化物标记的二抗，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；DMEM培养基、100 μg/mL碘化丙啶(PI)、Annexin-V-FITC，购于美国Sigma公司；MTT试剂盒购于普洛麦格北京生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、5×SDS蛋白上样缓冲液，购于天根生化科技有限公司；FBS，购于杭州四季青生物工程材料研究所。CO2培养箱，购于常州菲普实验仪器厂；倒置显微镜，购于日本尼康；RT-PCR仪，购于瑞士Roche公司；流式细胞仪，购于美国BD公司；Multiskan MK3 型酶标仪，购于芬兰 Thermo Labsys2tems公司。

1.3 细胞培养及处理 从液氮罐中取出装有HaCaT细胞的冻存管，放入37 ℃恒温水浴锅中快速解冻，待细胞冻存液融解后，将细胞移至5 mL无菌离心管中，加入含有10% FBS的DMEM培养液3 mL稀释冻存液中的DMSO，1 000 r/min离心5 min，去除上清液。加入新的培养液吹打重悬细胞沉淀，接种到细胞培养皿中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。细胞贴壁后换液1次，去除漂浮的死细胞，之后定期换液，待细胞融合度达80%以上时，用0.25%的胰酶消化并收集细胞，按1∶3的比例进行传代培养。取对数生长期的HaCaT细胞，去除细胞培养液，用PBS清洗细胞2次，用0.25%的胰酶消化，待细胞呈单个存在时终止消化，离心收集细胞沉淀。用培养液重悬、计数后，将细胞浓度调整为5×104/mL，每孔200 μL接种于经紫外照射灭菌的96孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，去除细胞培养液，将细胞随机分为Jagged1-Fc融合蛋白组、DAPT组、常规对照组，分别加入含(终浓度0、0.5、1、2 μg/mL)Jagged1-Fc融合蛋白、(终浓度0、5、10、20 μmol/L)DAPT、常规细胞培养液进行培养。

1.4 皮肤组织中Notch1、Jagged1 mRNA表达检测 用RT-PCR技术。取三组皮肤组织，用TRIzol法提取总RNA。紫外分光光度计检测总RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量；用PrimeScriptTM RT Reagent kit逆转录试剂盒合成将RNA逆转录成cDNA，用RT-PCR试剂盒检测。根据GenBank数据库中公布的人Notch1和Jagged1 mRNA序列，用Primer5.0软件设计RT-PCR引物，送上海派森诺生物科技有限公司合成，引物序列为Notch1-F：5′-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3′，Notch1-R：5′-CAGGTTGTACTCGTCCAGCA-3′；Jagged1-F：5′-GTCCCACTGGTTTCTCTGGA-3′，Jagged1-R：5′-CCACAGACGTTGGAGGAAAT-3′；β-actin-F：5′-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3′，β-actin-R：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAG-G-3′。RT-PCR扩增条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35个循环。用β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5 皮肤组织中Notch1、Jagged1蛋白及HaCaT细胞内Bcl-2、Bax、Keratin1、Involucrin蛋白表达检测 采用Western blotting法。取三组皮肤组织，按照蛋白提取试剂盒说明书提取皮肤组织总蛋白；HaCaT细胞经Jagged1-Fc融合蛋白、DAPT处理。用0.25%的胰酶消化、收集细胞，按照蛋白提取试剂盒说明书提取HaCaT细胞总蛋白。按照试剂盒说明书测定组织及细胞总蛋白浓度。蛋白上清液稀释至统一浓度后，与Loading buffer按体积4∶1混匀，100 ℃煮沸5 min使蛋白变性。将变性蛋白样品加入SDS蛋白凝胶上样孔中，每孔50 μL，常规方法垂直电泳。电泳结束取出蛋白凝胶，按照滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶、滤纸的顺序在4 ℃转膜过夜。PBST洗涤3次，PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，然后依次与一抗(500倍稀释)、二抗(1 000倍稀释)孵育，滴加ECL显色液，在暗室中曝光，用Odyssey成像系统扫描各条带灰度值，β-actin条带作为内参照。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6 HaCaT细胞增殖活力检测 采用MTT法。HaCaT细胞经Jagged1-Fc融合蛋白、DAPT处理，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24、48、72 h，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去培养液，加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min溶解蓝紫色结晶。用空白调零孔调零，用酶标仪测定波长570 nm处光密度(A)值，A值与细胞数量呈正比，以A值作为评价细胞增殖活力的指标。

1.7 HaCaT细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。取对数生长期的HaCaT细胞分别用终浓度为2 μg/mL的Jagged1-Fc融合蛋白、终浓度为20 μmol/L DAPT处理72 h，弃去细胞培养液，PBS清洗细胞2次，加入0.25%的胰蛋白酶消化、收集细胞，以不做处理的细胞作对照。细胞计数，用细胞培养液重悬细胞，调整细胞为1×106/mL。取细胞悬液1 mL加入1.5 mL离心管中，4 ℃，1 200 r/min，离心5 min，弃上清液。向细胞沉淀中加入Binding Buffer 200 μL，充分混匀后分别加入PI 5 μL和Annexin V-FITC 5 μL，避光室温孵育20～30 min，加入Binding Buffer 400 μL，用流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 各组皮肤组织中Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白的表达比较 正常组Notch1、Jagged1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.09、1.00±0.11，蛋白相对表达量分为0.39±0.12、0.67±0.08；对照组Notch1、Jagged1 mRNA相对表达量分别为1.16±0.16、1.17±0.21，蛋白相对表达量分别为 0.43±0.01、0.71±0.11；病例组Notch1、Jagged1 mRNA相对表达量分别为3.64±0.15、2.36±0.32，蛋白相对表达量分别为1.29±0.13、1.46±0.15。病例组Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相对表达量高于其他两组(P均<0.05)，对照组与正常组Notch1、Jagged1 mRNA及蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 Notch信号通路对HaCaT细胞增殖的影响 见表1。

表1 Jagged1-Fc融合蛋白组与DAPT组细胞增殖率比较

2.3 Notch信号通路对HaCaT细胞凋亡的影响 Jagged1-Fc融合蛋白组、DAPT组、常规对照组凋亡率分别为4.76%±1.13%、26.87%±3.18%、13.69%±2.05%；与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组细胞凋亡率降低、DAPT组升高(P均<0.05)。

2.4 Notch信号通路对HaCaT细胞凋亡相关蛋白表达的影响 常规对照组、Jagged1-Fc融合蛋白组、DAPT组Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.63±0.11、1.28±0.15、0.29±0.08，Bax蛋白相对表达量分别为0.57±0.08、0.16±0.08、1.17±0.16。与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组Bcl-2蛋白相对表达量升高，Bax蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；DAPT组Bcl-2蛋白相对表达量降低， Bax蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。

2.5 Notch信号通路对HaCaT细胞分化的影响 常规对照组、Jagged1-Fc融合蛋白组、DAPT组Keratin1蛋白相对表达量分别为0.53±0.08、0.29±0.06、1.03±0.14，Involucrin蛋白相对表达量分别为0.86±0.17、0.39±0.06、1.27±0.16。与常规对照组比较，Jagged1-Fc融合蛋白组Keratin1及Involucrin蛋白相对表达量降低(P均<0.05)；DAPT组Keratin1及Involucrin蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。

3 讨论

Notch信号通路是介导细胞之间相互接触的重要信号通路，在机体多种组织器官中均有表达，能够调控细胞增殖、分化、凋亡等过程[8]。研究证实Notch信号通路的异常激活与多种恶性肿瘤的发生相关。如刘天舒等[9]研究发现，阻断Notch信号通路能够抑制肺癌干细胞的生长。在造血系统中，Notch信号通路激活能够促进造血组细胞增殖并抑制其分化[10]。皮肤是人体重要的组织器官，与全身免疫系统密切相关，具有非特异性免疫防御功能。表皮多种细胞中均有Notch信号分子的表达。有研究报道，Notch信号通路关键因子Notch1、Notch2及HES-1在银屑病患者外周血T细胞中表达上调[11]；Jagged1是Notch信号通路的主要配体之一，有研究发现Jagged1在血热型银屑病表皮中表达增强[12]，提示Notch信号通路可能参与银屑病的发生过程。本研究采集了银屑病患者皮损区皮肤组织、周边非皮损区皮肤组织及正常人皮肤组织，用RT-PCR和Western blotting检测Notch信号通路配体受体Notch1、Jagged1的表达，发现Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白在银屑病患者皮损区皮肤组织呈现高表达。说明Notch信号通路与银屑病的发病过程相关，这与其他研究结果一致。

角质形成细胞是构成表皮结构的主要细胞，具有很强的增殖及分化能力，是皮肤组织免疫及屏障的重要功能细胞[13]。正常状态下，角质形成细胞的增殖与凋亡处于动态平衡状态，两者相互制约维持表皮的正常厚度与角质层的形成，其增殖、凋亡、分化异常会导致多种皮肤疾病的发生[14]。银屑病的发病机制尚不清楚，但是表皮角质形成细胞过度增殖及异常分化是其主要特点之一，多数学者还认为银屑病的发生与表皮角质形成细胞凋亡减少有关[15]。本研究以HaCaT细胞为实验材料，用Jagged1-Fc融合蛋白激活Notch信号通路，DAPT阻断Notch信号通路，结果显示，激活Notch信号通路能够促进HaCaT细胞增殖；而阻断Notch信号通路能够抑制HaCaT细胞增殖。

Bcl-2基因家族在通过线粒体途径调控细胞凋亡中具有重要作用，其中Bcl-2是一种抑凋亡基因[16]，Bax是一种促凋亡基因[17]，Bcl-2和Bax能够形成异源或同源二聚体，对细胞凋亡的调节作用由两者的比值决定，其中Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加，促进细胞的凋亡，反之则抑制细胞凋亡[18]。本实验结果显示，激活Notch信号通路能够抑制HaCaT细胞凋亡，并明显促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达；阻断Notch信号通路则能够促进HaCaT细胞凋亡，并明显抑制Bcl-2蛋白表达，促进Bax蛋白表达，提示Notch信号通路调控HaCaT细胞凋亡可能与Bcl-2基因家族相关。

Keratin1是表皮颗粒层特异性蛋白，Involucrin是棘皮层特异性蛋白，二者可作为HaCaT细胞分化的标志蛋白[19，20]。本研究发现，用Jagged1-Fc融合蛋白激活Notch信号通路能够下调Keratin1和Involucrin蛋白表达；用DAPT阻断Notch信号通路能够上调Keratin1和Involucrin表达，说明激活Notch信号通路能够抑制HaCaT细胞分化，阻断Notch信号通路能够促进HaCaT细胞分化。

综上所述，Notch信号通路关键因子在银屑病患者皮损区皮肤组织中表达上调，激活Notch信号通路能够促进角质形成细胞的增殖、抑制角质形成细胞的凋亡和分化。反之，阻断Notch信号通路能够抑制角质形成细胞的增殖、促进角质形成细胞的凋亡和分化。

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2016-11-01)