实时荧光定量PCR技术在分子生物学研究领域的应用

陈 曦

1 PCR技术的基本原理

PCR扩增即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，是在体外特异性地扩增某个基因的方法。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物[1]。但是在很多研究中感兴趣的是未经PCR 信号放大之前的起始模板量。例如想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号。随着反应时间的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过监测到的荧光信号的变化监测产物量的变化，从而绘制成一条荧光扩增曲线。

2 实时荧光定量PCR中的荧光检测

可用于实时荧光定量PCR的荧光化学方法多种多样，主要分为特异性的杂交探针和非特异性的荧光染料。杂交探针方法需设计与靶序列特异杂交的探针，并标记特殊荧光，如分子信标和Taqman等。非特异性的荧光染料则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，如DNA结合染料SYBR-Green I。探针类由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但成本较高，且探针与模板结合有一定的要求（PCR反应温度、反应液组成等）[2]。荧光染料法价格低廉，简单易行。SYBR-Green I是目前最为常用的荧光染料，其作用原理为：SYBR-Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可发光。因此，在PCR系统中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。

3 实时荧光定量PCR中的定量方法

绝对定量方法：获得的结果为起始模板数的精确拷贝数，通常利用已知的标准曲线来推算未知样本的量。选择合适的已知拷贝数的标准品，系列稀释后作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数和反应获得的Ct值绘制标准曲线。绝对定量的前提是要有一组稳定的标准品，可以是含有目的基因的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化PCR产物，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。但由于标准品和目的基因不在同一反应体系中扩增，所以无法检测也不能补偿可能出现的目的基因反应体系中的影响因素。

常用的相对定量计算方法是比较Ct法。使用该方法进行基因表达定量时，来自于同一样品的目的基因和内参基因都要进行实时定量PCR反应，其结果由目的基因与内参基因Ct之间的差值ΔCt来反应。比较常用的有2-ΔΔCt方法[3]。

目前实时荧光定量PCR已经称为分子生物学科研领域的主要技术手段，极大地简化了核酸定量检测的过程。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。例如随着生物芯片技术和荧光探针定量技术的结合，荧光定量PCR在医学检测及其他各个领域中的应用前景将更加广阔。

[1] 陈庄，邓存良，吴刚.分子生物学基本技术实验指导[M].科学出版社，2015.23-25.

[2] 魏群.分子生物学实验指导[M].高等教育出版社，2015.48-55.

[3] 叶棋浓.现代分子生物学技术及实验技巧[M].化学工业出版社，2015.176-179.