益生菌对生物絮团养殖系统中刺参幼参生长、消化酶和免疫反应的影响

张丛尧,任盟,左然涛,孙丕海,杨志平,乔雁冰,马悦欣

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁 大连116023;2.大连海洋大学海珍品苗种培育基地,辽宁 大连116023;3.大连汇新钛设备开发有限公司,辽宁大连116039)

益生菌对生物絮团养殖系统中刺参幼参生长、消化酶和免疫反应的影响

张丛尧1,任盟1,左然涛1,孙丕海2,杨志平3,乔雁冰1,马悦欣1

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁 大连116023;2.大连海洋大学海珍品苗种培育基地,辽宁 大连116023;3.大连汇新钛设备开发有限公司,辽宁大连116039)

为了解益生菌对生物絮团养殖系统中刺参Apostichopus japonicus幼参生长、消化酶和免疫反应的影响,选择体质量为 (10.77±0.07)g的健康幼参,随机分配到6个盛有20 L沙滤海水的聚乙烯养殖箱中,每箱放30头幼参,试验设对照组和益生菌组 (枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis+硝化菌),每组设3个平行,对照组每天投喂1次基础饵料 (约为幼参体质量的4%)并添加蔗糖 (基础饵料的70%),益生菌组在对照组基础上,每3 d向水体中添加枯草芽孢杆菌和硝化菌制剂各1.8 g,养殖试验共进行60 d。结果表明:与对照组相比,养殖30、60 d时,益生菌组幼参的特定生长率均显著提高 (P＜0.05);益生菌组幼参肠道淀粉酶和脂肪酶活力均显著增强 (P＜0.05),但胰蛋白酶活力与对照组无显著性差异 (P＞0.05);益生菌组幼参的体腔细胞吞噬活力、体腔液和体腔细胞裂解液溶菌酶活力均显著增强 (P＜0.05)。研究表明,生物絮团养殖系统中添加益生菌可促进幼参生长,提高消化酶活力和增强免疫反应。

刺参;益生菌;生物絮团养殖系统;消化酶;免疫反应

刺参Apostichopus japonicus是中国北方地区重要的海珍品养殖种类,具有较高的营养价值和经济价值[1]。目前,刺参养殖主要分布于山东、辽宁、河北、江苏、浙江、福建和广东省[2],2013年,全国刺参增养殖面积达20多万hm2,年产量近20 万t,产值约200亿元[3]。刺参养殖业的快速发展更加需要改进生产系统、加强生物安全和减少对环境影响的措施[4-5]。研究表明,将益生菌 (单一菌株或多株混合菌)加入到养殖水体或作为饲料添加剂,可促进刺参生长[6-12]、提高消化酶活性[6,11-15]和增强免疫功能[7-12,14,16-17]。 近年来, 生物絮团在刺参养殖中的应用受到国内学者越来越多的关注[18-21],生物絮团可促进幼参的生长,提高其消化道淀粉酶活性[20-21]。但是,在生物絮团养殖系统中添加益生菌对刺参生长、消化酶活力和免疫反应的影响研究极少[20]。本试验中,以蔗糖为碳源建立生物絮团系统,研究了水体中添加商品益生菌对幼参生长、消化酶和免疫反应的影响,旨在为益生菌在刺参生物絮团养殖系统中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康幼参购自辽宁省大连市某刺参养殖场。基础饵料配方 (干质量):海带粉14%、小麦粉24%、鱼粉5%、豆粕4%、多维1%、多矿1%、啤酒酵母1%、玉米秸秆粉50%。饵料中粗蛋白质含量为14.6%。

固体菌剂超级硝化菌和富硒-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 5×1010cells/g)分别购自台湾雷尔公司和盐城市神微微生物菌种科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 将幼参在水温15℃下暂养7 d后开始试验。选择体质量为 (10.77±0.07)g的幼参,随机分配到6个盛有20 L沙滤海水的聚乙烯养殖箱 (50 cm×40 cm×38 cm)中,每箱放30头幼参,以鹅卵石和网片为附着基,试验设对照组,每天投喂1次基础饵料并添加蔗糖 (基础饵料的70%),投喂量约为幼参体质量的4%,益生菌组在对照组基础上,每3 d向水体中添加硝化菌+枯草芽孢杆菌制剂各1.8 g。每组设3个平行,每10 d换水1/3,用气石充气。试验期间,水温为(15.5±0.34)℃,溶解氧为 (5.2±0.48)mg/L,盐度为32.1±0.31,pH为7.86±0.14,养殖试验共进行60 d。

1.2.2 幼参生长指标的测定 分别于养殖0、30、60 d时测定幼参体质量,并计算幼参的特定生长率(SGR):

SGR=(ln Wt-ln W0)/t×100%。

其中:Wt为t时的幼参体质量 (g);W0为初始幼参体质量;t为试验时间 (d)。

1.2.3 肠道消化酶活力的测定 将幼参分别养殖30 d和60 d时,从每箱中随机取5头幼参,饥饿48 h,将肠道内容物排空,解剖取其肠道,用滤纸吸干,称重后加入9倍体积 (1 g∶9 mL)预冷的生理盐水,匀浆,于4℃下以6000 r/min离心10 min,取上清液用于消化酶活力的测定。使用南京建成生物工程公司生产的试剂盒测定肠道淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活力。

1.2.4 幼参免疫指标的测定 体腔液的采集与处理以及体腔液上清液和体腔细胞裂解上清液的制备方法同文献[22]。体腔细胞吞噬活力测定方法见文献[14]。体腔液上清液和腔细胞裂解上清液溶菌酶活力测定方法依据文献[22]。

1.2.5 蛋白含量的测定 肠道上清液、体腔液和体腔细胞裂解上清液中总蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法,以小牛血清白蛋白作为标准蛋白[23]。

1.3 数据处理

试验数据用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析和 T检验,结果以平均值±标准差 (mean± S.D.)表示,显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 各组幼参的生长情况

幼参特定生长率如图1所示,养殖30、60 d时益生菌组幼参的特定生长率均显著高于对照组(P＜0.05)。

图1 益生菌对幼参特定生长率的影响Fig.1 Effect of probiotics on specific growth rate of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 各组幼参肠道消化酶活力的变化

幼参肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活力如表1所示。从表1可知,养殖30、60 d时益生菌组幼参肠道淀粉酶和脂肪酶活力均显著高于对照组(P＜0.05),但胰蛋白酶活力与对照组无显著性差异 (P＞0.05)。

2.3 各组幼参免疫指标的变化

幼参体腔细胞吞噬活力、体腔液和体腔细胞裂解液溶菌酶活力如表2所示。从表2可知,养殖30、60 d时益生菌组幼参体腔细胞吞噬活力、体腔液和体腔细胞裂解液溶菌酶活力均显著高于对照组 (P＜0.05)。

3 讨论

3.1 益生菌对幼参生长的影响

本试验中,在生物絮团养殖系统水体中添加枯草芽孢杆菌+硝化菌可显著促进幼参生长,与李斌等[20]报道的结果类似,即与以蔗糖为碳源产生的生物絮团相比,定期添加复合芽孢杆菌 (枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis+地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis)形成的生物絮团可显著提高幼参生长。这一结果可能与益生菌或其形成的生物絮团 (益生菌组生物絮团生成量显著高于对照组)能改善水质 (降低水体中的氨氮和亚硝氮浓度)和增加消化酶活性有关。在对虾生物絮团养殖系统中也有类似的研究结果,Souza等[24]报道,在桃红对虾Farfantepenaeus brasiliensis零交换好氧异养培养系统 (以糖蜜为碳源)中,添加商业益生菌Sanolife Pro-W(枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis+短小芽孢杆 Bacillus pumilus)、Biomin Start-grow(一种芽孢杆菌Bacillus spp.+一种肠球菌Enterococcus spp.+若干种乳酸杆菌Lactobacillus spp.)和Bacillus cereus var.toyoi,可显著提高对虾的体质量和特定生长率。在感染副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei生物絮团养殖系统 (以糖蜜为碳源)中,水体中添加商业益生菌AquaStar®Pond(若干种芽孢杆菌+若干种肠球菌+若干种硫杆菌Thiobacillus spp.+若干种副球菌 Paracoccus spp.)和饵料中添加AquaStar®Growout(若干种芽孢杆菌+若干种肠球菌+若干种硫杆菌),可显著提高仔虾的生长和存活率[25]。在养殖水体中添加巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium+美丽盐单胞菌Halomonas venusta+赤砂糖,与只添加赤砂糖的对照组比较,凡纳滨对虾体长和体质量均显著增加[26]。

表1 益生菌对幼参肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活力的影响Tab.1 Effect of probiotics on the intestinal amylase,lipase and trypsin activities in sea cucumber juvenile Apostichopus japonicus

表2 益生菌对幼参体腔细胞吞噬活力、体腔液和体腔细胞裂解液溶菌酶活力的影响Tab.2 Effect of probiotics on the phagocytic activity of coelomocytes and lysozyme activities in coelomic fluid and in coelomocyte lysate supernatant in sea cucumber juvenile Apostichopus japonicas

3.2 益生菌对幼参消化酶活力的影响

适宜浓度的益生菌/生物絮团在水生动物的消化过程中起着有益的作用[11-15,21,27]。 董春光等[12]将不同剂量的枯草芽孢杆菌菌粉添加到幼参养殖水体中,结果显示,刺参肠道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活力显著增加。幼参培育水体中添加蔗糖和生物絮团发酵液 (含芽孢杆菌)可提高其消化道淀粉酶活性[21]。饵料中添加4%生物絮团可显著提高斑节对虾Penaeus monodon幼体肝胰腺消化酶 (淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶)活力[27]。本试验中,在幼参生物絮团养殖系统 (以蔗糖为碳源)水体中添加枯草芽孢杆菌+硝化菌,可使幼参肠道淀粉酶和脂肪酶活力显著提高,可能是生物絮团中微生物群落影响幼参肠道细菌群落结构所致[28]。

3.3 益生菌对幼参非特异免疫反应的影响

已有研究表明,益生菌/生物絮团可刺激水生动物的非特异性免疫反应[7-12,14,16-17,29-30]。 体腔细胞起着吞噬、诱捕和包裹入侵微生物的作用,构成棘皮动物抵御感染和损伤的第一道防线[31]。Zhang 等[7]和Zhao等[8]报道,在饵料中分别添加内源枯草芽孢杆菌T13和外源枯草芽孢杆菌,可显著提高幼参体腔细胞的吞噬活力。在凡纳滨对虾水交换系统中,通过添加蔗糖形成的生物絮团能显著增强其血细胞的吞噬活力[29]。本试验中,在生物絮团养殖系统水体中添加益生菌,可显著增强幼参体腔细胞吞噬活力。溶菌酶抵抗革兰氏阳性细菌病原侵入的作用机制,主要是催化其细胞壁中肽聚糖组分N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间β-1,4糖苷键的水解[32]。向水体泼洒和拌饵投喂蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus BC-01,可使幼参体腔液溶菌酶活力增加[11]。在饵料中添加浓度为2.5%的生物絮团,凡纳滨对虾血清中溶菌活力显著增强[30]。本研究中,益生菌可显著增强幼参体腔液和体腔细胞裂解液中溶菌酶活力。溶菌酶除了可有效抵抗革兰氏阳性细菌外,还可直接促进吞噬作用,这可能与益生菌增强吞噬作用有关[33]。幼参非特异免疫反应的激活可能是由于生物絮团中大量细菌细胞壁组分的作用[34]。此外,由于所用枯草芽孢杆菌富含硒和多种活性微量元素,所以也不排除这些元素对幼参免疫反应的影响[35]。

在刺参养殖水体中添加商业用益生菌不易形成优势菌,因此,应进一步研究土著益生菌结合生物絮团技术在刺参苗种培育中的应用。

[1] 于东祥.海参健康养殖技术[M].北京:海洋出版社,2005: 275-280.

[2] 何翠,黄国强.全国及主要刺参养殖省份刺参养殖状况分析[J].渔业信息与战略,2014,29(1):24-30.

[3] 薄学锋,刘金明,董晓亮,等.利用地热循环水加温进行黄河口刺参苗种繁育技术研究[J].齐鲁渔业,2016(1):1-5.

[4] Qi Zizhong,Zhang Xiaohua,Boon N,et al.Probiotics in aquaculture of China—Current state,problems and prospect[J].Aquaculture,2009,290(1-2):15-21.

[5] Crab R,Defoirdt T,Bossier P,et al.Biofloc technology in aquaculture:beneficial effects and future challenges[J].Aquaculture, 2012,356-357:351-356.

[6] 袁成玉,张洪,吴垠,等.微生态制剂对幼刺参生长及消化酶活性的影响[J].水产科学,2006,25(12):612-615.

[7] Zhang Qin,Ma Hongming,Mai Kangsen,et al.Interaction of dietary Bacillus subtilis and fructooligosaccharide on the growth performance,non-specific immunity of sea cucumber,Apostichopus japonicus[J].Fish&Shellfish Immunology,2010,29(2):204-211.

[8] Zhao Yancui,Zhang Wenbing,Xu Wei,et al.Effects of potential probiotic Bacillus subtilis T13 on growth,immunity and disease resistance against Vibrio splendidus infection in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Fish&Shellfish Immunology, 2012,32(5):750-755.

[9] Li Jianguang,Xu Yongping,Jin Liji,et al.Effects of a probiotic mixture(Bacillus subtilis YB-1 and Bacillus cereus YB-2)on disease resistance and non-specific immunity of sea cucumber, Apostichopus japonicus(Selenka)[J].Aquaculture Research, 2015,46(12):3008-3019.

[10] Yang Gang,Tian Xiangli,Dong Shuanglin,et al.Effects of dietary Bacillus cereus G19,B.cereus BC-01,and Paracoccus marcusii DB11 supplementation on the growth,immune response,and expression of immune-related genes in coelomocytes and intestine of the sea cucumber(Apostichopus japonicus Selenka)[J].Fish& Shellfish Immunology,2015,45(5):800-807.

[11] 田相利,赵坤,王军,等.泼洒和投喂芽孢杆菌对刺参生长以及消化和免疫相关酶活性的影响[J].中国海洋大学学报, 2015,45(1):18-25.

[12] 董春光,杨爱国,孙秀俊,等.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在刺参养殖中的益生作用[J].渔业科学进展,2015,36(3): 109-115.

[13] 张涛,白岚,李蕾,等.不同添加量的益生菌组合对仿刺参消化和免疫指标的影响[J].大连水产学院学报,2009,24(S): 64-68.

[14] 刘姣,韩华,孙飞雪,等.饵料中添加芽孢杆菌BC26对刺参幼参消化酶、免疫反应和抗病力的影响[J].大连海洋大学学报,2013,28(6):568-572.

[15] 李丽丽,关晓燕,顾英,等.芽孢杆菌B4对刺参肠道免疫酶及消化酶的影响[J].饲料研究,2015(3):58-61.

[16] 李璐瑶,孙丕海,包鹏云,等.饲料中添加混合益生菌对刺参幼参免疫反应和抗氧化性能的影响[J].大连海洋大学学报, 2016,31(3):266-271.

[17] Zhao Yancui,Yuan Lei,Wan Junli,et al.Effects of potential probiotic Bacillus cereus EN25 on growth,immunity and disease resistance of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus[J].Fish &Shellfish Immunology,2016,49:237-242.

[18] 李爽,李耕,潘玉洲,等.生物絮团技术对工厂化养殖海参生长及存活率的影响[J].科学养鱼,2011(11):65-66.

[19] 马元庆,李斌,张秀珍,等.生物絮团对仿刺参幼参消化与免疫酶活性的影响[J].水生态学杂志,2013,34(6):91-95.

[20] 李斌,张秀珍,马元庆,等.生物絮团对水质的调控作用及仿刺参(Apostichopus japonicus)幼参生长的影响[J].渔业科学进展,2014,35(4):85-90.

[21] 张秀珍,李斌,白艳艳,等.生物絮团对仿刺参幼参生长与酶活性的影响[J].中国水产科学,2014,21(4):793-799.

[22] 李明.混合益生菌对刺参生长、免疫、消化和肠道菌群的影响[D].大连:大连海洋大学,2012.

[23] Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72(1-2):248-254.

[24] Souza D M D,Suita S M,Leite F P L,et al.The use of probiotics during the nursery rearing of the pink shrimp Farfantepenaeus brasiliensis(Latreille,1817)in a zero exchange system[J].Aquaculture Research,2012,43(12):1828-1837.

[25] Krummenauer D,Poersch L,Romano L A,et al.The effect of probiotics in a Litopenaeus vannamei biofloc culture system infected with Vibrio parahaemolyticus[J].Journal of Applied Aquaculture,2014,26(4):370-379.

[26] 王志杰.两株益生菌在凡纳滨对虾生物絮团养殖中的应用[D].青岛:中国海洋大学,2014.

[27] Anand P S S,Kohli M P S,Kumar S,et al.Effect of dietary supplementation of biofloc on growth performance and digestive enzyme activities in Penaeus monodon[J].Aquaculture,2014,418-419:108-115.

[28] Xu Wujie,Pan Luqing.Effects of bioflocs on growth performance, digestive enzyme activity and body composition of juvenile Litopenaeus vannamei in zero-water exchange tanks manipulating C/N ratio in feed[J].Aquaculture,2012,356-357:147-152.

[29] Xu Wujie,Pan Luqing.Enhancement of immune response and antioxidant status of Litopenaeus vannamei juvenile in biofloc-based culture tanks manipulating high C/N ratio of feed input[J].Aquaculture,2013,412-413:117-124.

[30] 孙振,王秀华,黄倢.一种微生物絮团的生化分析及其对凡纳滨对虾免疫力的影响[J].水产学报,2013,37(3):473-480.

[31] Gliński Z,Jarosz J.Immune phenomena in echinoderms[J].Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis,2000,48(3): 189-193.

[32] Jollès P,Jollès J.What's new in lysozyme research?Always a model system,today as yesterday[J].Molecular and Cellular Biochemistry,1984,63(2):165-189.

[33] Saurabh S,Sahoo P K.Lysozyme:an important defence molecule of fish innate immune system[J].Aquaculture Research,2008, 39(3):223-239.

[34] Kim S K,Pang Zhenguo,Seo H C,et al.Effect of bioflocs on growth and immune activity of Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei postlarvae[J].Aquaculture Research,2014,45(2): 362-371.

[35] 王吉桥,王志香,于红艳,等.饲料中不同类型的硒对仿刺参幼参生长和免疫指标的影响[J].大连海洋大学学报,2011, 26(4):306-311.

Effects of probiotics on growth,digestive enzyme activity,and immune response of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus in a biofloc culture system

ZHANG Cong-yao1,REN Meng1,ZUO Ran-tao1,SUN Pi-hai2, YANG Zhi-ping3,QIAO Yan-bing1,MA Yue-xin1
(1.Key Laboratory of Mariculture and Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Seafood Seedling Breeding Base,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;3 Dalian Huixin Titanium Equipment Development Company Limited,Dalian 116039,China)

Sea cucumber Apostichopus japonicus with body weight of(10.77 g±0.07 g)were randomly divided into six 20 L sand filtered sea water tanks at a density of 30 individuals per tank,and fed the basal diet(70%basal diet)containing sucrose(control).In the probiotics treatment,however,the sea cucumber was fed the same diet as in the control in the water which was added into a mixture of Bacillus subtilis(1.8 g)plus nitrifiers(1.8 g)in a 3 day interval at feeding rate of about 4%for 60 days to evaluate the effects of commercial probiotics on growth,digestion,and immune response of juvenile sea cucumber in biofloc culture system.Results showed that there was significantly higher specific growth rate in the sea cucumber fed the diet containing probiotics than that in the control during 30 d and 60 d rearing(P＜0.05).The sea cucumber in the probiotics had significantly higher intestinal amylase and lipase activities than those in control did(P＜0.05),without significant differences in trypsin activity between probiotics treatment and the control(P＞0.05).The phagocytic activity of coelomocytes and the lysozyme activity in coelomic fluid and in coelomocyte lysate supernatant were shown to be significantly enhanced in probiotics treatment compared with the control(P＜0.05).The findings revealed that probiotics supplementation improved the growth,digestion and immune response of juvenile sea cucumber in a biofloc culture system.

Apostichopus japonicus;probiotics;biofloc culture system;digestive enzyme;immune response

Q939.9;S968.9

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.01.012

2095-1388(2017)01-0068-05

2016-10-11

辽宁省教育厅科研项目 (L2014288)

张丛尧 (1960—),男,讲师。E-mail:zhangcongyao@dlou.edu.cn

马悦欣 (1963—),女,教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn