HPLC-Q-TOF法筛查鸡肉中48种兽药残留

孙清荣，郭礼强，张金玲，刘永强

（1.山东科技职业学院，山东潍坊261053；2.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041）

HPLC-Q-TOF法筛查鸡肉中48种兽药残留

孙清荣1，郭礼强2，张金玲2，刘永强2

（1.山东科技职业学院，山东潍坊261053；2.潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041）

利用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）建立了鸡肉中48种兽药残留的快速筛查和检测方法。样品采用乙腈/水（7∶3，体积比）提取，经OasisPRiMEHLB固相萃取柱净化，采用UPLC-Q-TOF/MS检测，正离子全信息串联质谱模式扫描，外标法定量。建立了目标分析物一级精确质量数据库和谱图库，通过化合物的精确质量数、保留时间等对检测结果进行检索，从而在无对照标准品的情况下可以对目标分析物进行定性鉴定。结果表明，鸡肉中48种兽药的定量限（LOQ，S/N=10）为3.0μg/kg～30μg/kg，在3.0μg/L～300μg/L范围呈良好线性，线性相关系数均大于0.99。该方法灵敏、简便、准确，可用于鸡肉中多种兽药残留的检测分析。

飞行时间质谱；高效液相色谱；兽药；鸡肉；多残留

兽药广泛的应用于肉鸡养殖业中，一定量的使用可以预防和治疗动物疾病，减少养殖企业的损失，但是若违法添加、使用不当或过量使用会引起鸡肉组织中药物过度残留，并通过食物链进入人体，导致人体产生抗药性、过敏反应等，兽药残留严重的甚至诱导疾病的发生，从而危害消费者健康。因此，评估和监管常用兽药在鸡肉制品中的药物残留对保护消费者的权益和食品安全具有积极意义。

目前对兽药残留的检测方法主要为液相色谱法[1]和液相色谱-串联质谱法[2-6]。鸡肉基质比较复杂，随着食品安全越来越严厉的监管需求，以及兽药残留标准的完善和限量要求越来越低，液相色谱法的灵敏度、通量和限量已经不能满足检测需求，而液相色谱串联质谱具有更高的灵敏度和选择性，使其更适于多兽药残留同时检测和微量残留分析。四极杆-飞行时间质谱属于高分辨质谱，具有质量范围广，质量精度和分辨率高、分析全面等优点，可根据化合物准分子离子的精确分子质量对其进行定性分析，极大的提高了复杂背景下的抗干扰能力，而质谱获得的全扫描谱图可以用于建立化合物质谱数据库，因此能够在不使用标准品的情况下通过已有数据库对未知样品中的化合物进行定性判断[7-9]。目前国内使用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱检测鸡肉中兽药的报道较少，因此，其方法的开发利用在动物源性食品兽药残留检测方面具有良好的应用前景。

本试验以鸡肉为研究对象，以OasisPRiMEHLB固相萃取柱为净化手段，采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱同时检测鸡肉中多种药物残留，并建立了其质谱筛查库。本方法具有快速、高效、准确和高通量等特点，为食品质量安全的监控提供了新的检测技术选择。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent1260-G6530高效液相色谱-高分辨质谱联用仪[配电喷雾离子源（ESI）]：美国Agilent公司；5810R型离心机：Eppendorf公司；N-EVAP氮吹仪：Organomation Associates公司；Milli-Q纯水机：美国Millipore公司；AE163天平：瑞士Mettler公司；T25均质器、MS1振荡器：德国IKA公司；5mL一次性注射器；0.22μm针头过滤器。

Sulfaphenazole（磺胺苯吡唑）、Sulfabenzamide（磺胺苯酰）、Sulfanilacetamide（磺胺醋酰）、Sulfamoxol（磺胺恶唑）、Sulfamethazine（磺胺二甲基嘧啶）、Sulfamethoxazole（磺胺甲恶唑）、Sulfamethizole（磺胺甲二唑）、Sulfamethoxypyridazine（磺胺甲氧哒嗪）、Sulfameter（磺胺甲氧嘧啶）、Sulfamerazine（磺胺甲嘧啶）、Sulfamonomethoxine（磺胺间甲氧嘧啶）、Sulfochlorpyridazine（磺胺氯哒嗪）、Sulfisomidine（磺胺索嘧啶）、Sulfisoxazole（磺胺异恶唑）、Sulfapyridine（磺胺吡啶）、Sulfaquinoxaline（磺胺喹噁啉）、Sulfadiazine（磺胺嘧啶）、Sulfathiazole（磺胺噻唑）、Sulfaguanidine（磺胺脒）、Sulfadimethoxine（磺胺二甲氧嘧啶）、Sulfisomidine（磺胺二甲基异嘧啶）、Trimethoprim（甲氧苄啶）、Sulfadione（氨苯砜）、Oxolinic acid噁喹酸）、Danofloxacin（达氟沙星）、Triamcinolone acetodide（曲安奈德）、Flumequine（氟甲喹）、Ciprofloxacin（环丙沙星）、Lomefloxacin（洛美沙星）、Chloramphenicol（氯霉素）、Norfloxacin（诺氟沙星）、Pefloxacin（培氟沙星）、Sarafloxacin（沙拉沙星）、Cinoxacin（西诺沙星）、Ofloxacin（氧氟沙星）、Enoxacin（伊诺沙星）、Nalidixic acid（萘啶酸）、Orbifloxacin（奥比沙星）、Dexamethasone（地塞米松）、Methylprednisolone（甲基泼尼松龙）、Cortisone（可的松）、Cefotaxime（头孢噻肟）、Hydrocortisone（氢化可的松）、Prednisolone（泼尼松龙）、Amantadine（金刚烷胺）、Penicillin V（青霉素V）、Ampicillin（氨苄青霉素）、Amoxicillin（阿莫西林）：购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸（色谱纯）：美国Biopure公司。

1.2 样品处理

取绞碎鸡肉样品2.0g，加入70%乙腈水溶液10mL，均质器均质1min，10 000 r/min高速离心10min，取全部上清液直接加载到PRiMEHLB固相萃取柱，控制流速在1min 3mL，并用1mL乙腈冲洗萃取柱，收集全部流出液，加入10mL甲醇混匀，30℃水浴氮气吹干，用乙腈水（70∶30，体积比）1mL定容后过0.22μm滤膜后经质谱检测。

1.3 液相色谱串联质谱条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）。流动相A：水/乙腈/甲酸（900∶99∶1，体积比）加5mmol乙酸铵。流动相B：乙腈/甲酸（999∶1，体积比）。梯度洗脱程序：0→2.0min，5%B；2.0min→10.0min，5%B→80%B；10.0min→16.0min，80%B→95%B；16.0min→17.0min，95%B→5%B；平衡5.0min。进样体积：10μL。流速：0.3mL/min。参比质量：质量范围（M/ Z）121.050 9和922.009 8。

1.3.2 质谱条件

雾化器温度：350℃；干燥器流量：10 L/min；喷雾器压力：315 000Pa；离子极性：正离子；数据储存方式：柱状图；电压：4 000V。

1.4 建立筛查库

[7]，配制浓度为1mg/L的兽药标准品，在不同碰撞能量下分别对目标化合物进行测定，采集二级谱图库所需数据，建立目标化合物一级质谱全扫描筛查库。通过库检索，以目标化合物的一级质谱精确分子量、保留时间、同位素丰度匹配、特征离子等信息进行定性分析。

表1 分析物的质谱参数及保留时间Table1 MS/MS parameters and retention times of analytes

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

所测定的48种兽药质荷比在152～460，化学性质相差较大，要达到良好分离比较困难，尤其是分子式相同或结构式相近化合物，且有相近或相同的碎片离子，出峰时间不合适易造成谱图干扰，影响谱库检索时化合物定性的判断。试验发现流动相为甲醇-水（各含0.1%甲酸）时，磺胺类化合物的峰形不好，分离度达不到要求。参考文献[6]，调整流动相为乙腈-水，经反复试验确定了“1.2”所述流动相比例以及梯度洗脱方法，应用该方法时基线平稳，各组分能较好分离，化合物的二级谱图无干扰且响应值高。

2.2 质谱条件的优化

高分辨质谱检测流程简单高效，非常适合做目标分析物和未知样品的筛查，对于已知化合物可通过标准品建立化合物的一级和二级谱图库，从而通过样品质谱扫描后分子式查找，原始数据提取，谱库比对结果，直接对化合物定性、定量，从而大大提高工作效率。将目标化合物分别配制成质量浓度为10mg/L的标准溶液。采用Q-TOF进行质谱数据的采集，以环丙沙星（精确m/z为332.140 8）为例，图1为全扫描下环丙沙星经过谱库检索获得的质谱图，通过谱库检索，可以初步推断化合物的名称、结构式等。统计48种物质的保留时间和质谱信息（见表1），建成质谱库，包含保留时间、母离子、子离子等。

2.3 样品提取条件的选择

图1 环丙沙星提取离子流图Fig.1 High resolution extracted ion chromagograms of Ciprofloxacin

鸡肉基质干扰较多，若直接采用提取液提取禽肉中的目标分析物，样品中的脂肪、蛋白质等会干扰目标分析物在质谱上的检测，同时减少色谱柱的寿命。目前，国内外在动物源性食品中多种兽药残留的提取和净化方法已有较多报道，萃取溶剂主要是乙腈[10-11]和甲醇[12]。试验考察了乙腈和甲醇对提取回收率的影响，结果表乙腈比甲醇有更好的去蛋白能力，回收率要比后者平均高5%以上。阿莫西林属于β-内酰胺类抗生素，极性偏高，过酸过碱溶液均不稳定，若仅用乙腈提取回收率偏低，试验考察了不同体积比的乙腈水对回收率的影响，最终确定70%的乙腈水回收率最好。过净化柱的溶液因为含有约30%的水，氮气不容易吹干且时间过长，影响目标分析物的回收率，通过多次验证，试验中在净化液中添加10mL甲醇混匀后氮吹，可以提高氮吹速度两倍以上，降低了氮吹过程中目标分析物的损失。

2.4 线性关系、检出限与定量下限

根据目标分析物在质谱中响应的强弱，配制不同浓度的混合标准溶液（用空白鸡肉提取液配制）进行测定，以各化合物峰面积的平均值（Y）对其质量浓度（X，μg/L）绘制标准曲线，其相关系数（r）均大于0.99。参照标准曲线的最低浓度，通过在鸡肉基质中添加混合标准物质，以信噪比（S/N）为3确定方法的检测限（LOD），以信噪比（S/N）为10确定方法的定量下限（LOQ），48种兽药的LOD在1.0μg/L～10μg/L之间，LOQ在3.0μg/L～30μg/L之间。48种兽药的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量下限见表2。

2.5 实际样品的测定

采用本方法对20份市场购买的鸡肉样品进行检测，结果发现一份鸡肉样品中检出磺胺二甲氧嘧啶，含量为10.1μg/kg，为了检验结果的准确性，我们引用质检总局行业标准SN/T 3155-2012《出口猪肉、虾、蜂蜜中多类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》对阳性样品进行验证，检测结果为10.3μg/kg，与筛查检测结果比较吻合，结果见图2。

表2 48种兽药的线性方程、相关系数、线性范围、检出限与定量下限（n=6）Table2 Linear relationships，correlation coefficients（r），linear ranges，LODs and LOQs of 48 veterinary drugs（n=6）

图2 阳性鸡肉样品谱库检索结果Fig.2 The search result to library of spectrogram for positive samples in chicken

3 结论

本文利用固相萃取净化柱，结合液相色谱-高分辨质谱技术，建立了同时测定鸡肉中48种兽药残留的分析方法。本方法快速、简便、高效，适用于鸡肉中兽药的快速定性筛查。

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Screening and Determination of 48 Veterinary Drug Residues in Chicken by High Performance Liquid Chromatography/Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry

SUN Qing-rong1，GUO Li-qiang2，ZHANG Jin-ling2，LIU Yong-qiang2
（1.Shandong Vocational College of Science and Technology，Weifang261053，Shandong，China；2.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang261041，Shandong，China）

An analytical method was established for the simultaneous determination of 48 veterinary drug residues in chicken by high performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF/MS）.The samples was extracted with acetonitrile and water（7∶3，volume ratio），and determined by UPLC-Q-TOF/MS after cleaned-up by solid phase extraction with a Oasis PRiME HLB cartridge.The target compounds was quantified by external standard method with acquisition under positive ion mode was performed to obtain accurate relative molecular masses.A date base containing the accurate mass numbers and a library which contains the 48 veterinary drugs were established.According to the characteristics of accurate mass，retention time and so on，the qualitative identifications of48 veterinary drugs were accomplished without the contrast of standard substances.The results showed that the calibration curves were linear in the range of3.0μg/L-300μg/L for 48 veterinary drugs with correlation coefficient（r）more than 0.99.The lim its of quantitation（LODs，S/N=10）were in the range of3.0μg/kg-30μg/kg.The method was sensitive，convenient and accurate，and could satisfy the demand of detection and analysis of veterinary drug residues in chicken.

time of flight mass spectrometry；high performance liquid chromatography；veterinary drug；chicken；multiresidue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.027

2016-05-24

潍坊市2015年科学技术发展计划（2015ZJ1101）；山东出入境检验检疫局科研基金项目（SK201420）

孙清荣（1970—），女（汉），副教授，硕士，主要研究方向：分析检测。