克伦特罗的检测方法研究进展

伍晓红，邢磊，聂婉，陈秋玲，王琤，*

（1.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330013；2.江西省兽药饲料监察所，江西南昌330029）

克伦特罗的检测方法研究进展

伍晓红1，邢磊2，聂婉1，陈秋玲1，王琤1，*

（1.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌330013；2.江西省兽药饲料监察所，江西南昌330029）

综述克伦特罗的检测方法研究进展，分别对各种检测方法的特点进行讨论，并对克伦特罗的检测方法的研究前景进行了展望，以期对畜产品安全检测有一定的参考作用。

畜产品；克伦特罗；检测

克伦特罗（Clenbuterol hydrochloride，CL）是一种β-兴奋剂，化学名为羟甲叔丁肾上腺素，俗称瘦肉精，可通过改变猪的代谢途径而将其胴体瘦肉率最少提高10%[1-2]。人食用含CL的畜产品15min后到6 h之间，会出现肌肉抽搐、呕吐、发热等中毒症状，持续时间90min甚至6 d。我国明确禁止在饲料及饮水中添加CL，但大面积的CL中毒事件仍然时有发生，其造成的影响极为恶劣[3]。因此，研究更高效、迅速的检测方法对可有效地监测畜产品安全、保障消费者的健康。目前针对猪体内残留的CL的检测普遍选取的的样品是猪尿与猪肉，且国家相关法律法规要求被检样品中不得检出CL，因此相应方法的CL检出限即为其判定限。当下已有不少较为成熟的相应的检测技术已经面世，但在一些较早的报道中其改进情况以及近年研发的一些新兴检测技术未完全被推广。因此本文就猪尿与猪肉中CL的检测方法及最新研究进展作一概述，以期对实际检测有一定的参考作用。

1 感官检测法

感官检测法是最直接、简便的方法，通过肉眼等感官对生猪、猪肉进行直接观察来初步判断猪肉中是否含有CL。肉眼观察未屠宰的生猪，若背毛稀疏松软，皮肤白里泛红，腹部无下坠感，臀部结实，背部在驱打后易见伤痕；屠宰后猪肉肉色鲜艳、肉质松软，后臀脂肪层极薄，肌肉鼓起，腹股沟布有充血的毛细血管[4]，则可判断猪肉中可能含有CL。感官检测法对检测人员的技术要求极低，适用于对猪肉中是否含有大量CL进行的粗略估测，但无法准确判定CL的含量，且由于不同人员的判定标准不同而容易造成误判。

2 免疫分析技术（IA）

2.1 放射免疫分析法（RIA）

RIA又称放射免疫检测法，利用放射性核素对抗原或抗体进行标记，再检测后者与待测物质结合形成的带放射性的免疫反应产物从而间接检测待测物质含量的方法，最早由Ropita等报道将其应用于CL的分析。RIA具有高灵敏度、特异性强的优点，但是技术难度大，放射性废物不易处理，仪器昂贵，且放射性同位素对操作员有一定的伤害[5]。因此RIA法一般难以广泛使用。林杰等[6]对猪尿样本进行CharmⅡRIA测定，得出其检测限为200μg/L。由于其检测限远高于其他常用的现行CL检测方法，因此RIA法不能很好地满足监管部门CL的检测要求。

2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA是基于酶免疫法（EIA）建立的一种应用较为广泛的检测方法。免疫吸附剂为固定的抗原或抗体，与酶标记的待测物发生特异性结合后，再与酶作用的底物显色剂发生反应而显色，通过观测或用酶标仪器测定而判定CL的浓度，常见的类型有间接法、双抗夹心法、竞争法[7]。ELISA法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、高通量的优点，GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》中所规定的检测方法的最低检出限为0.5μg/L，而经过改进的ELISA的最低检出限可降低到0.1μg/L。但由于其检测结果基于酶作用，检测过程中对温度、光照要求较高，同时存在假阳性率较高的问题。林爱玉[8]对生猪尿液进行CL检测时发现ELISA在低于20℃、高于25℃的环境进行检测均可能造成结果偏差，假阳性率高达15%～20%。

2.3 化学发光酶免疫法（CLEIA）

CLEIA是基于RIA和ELISA发展的一种分析方法，以碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化物酶（HRP）作为标记酶，以鲁米诺等发光剂作为底物，利用鲁米诺与过氧化氢构成的化学发光体系进行标记反应，从而检测CL浓度。CLEIA法兼备RIA和EILSA法的优点，同时克服了ELISA精密性差的缺点。徐晓婴[9]等对CLEIA法的反应温度、竞争反应时间等参数进行优化，CL测定的线性检测范围可达到0.04μg/L～42.5μg/L。王硕等[10]建立的直接竞争化学发光酶免疫法（dc-CLEIA）优化了离子强度和pH值，使优化后的dc-CLEIA对猪肉样本中的CL的样本回收率在83%～98%之间。杨金易等[11]进一步优化了dc-CLEIA法，猪肉样品CL的回收率提高至91.0%～103.3%，猪尿样品CL的回收率为93.4%～100.3%。

2.4 胶体金免疫层析法（GICA）

GICA法以胶体金作为示踪标记物，标记特异性CL单克隆抗体。一般使用拼装的胶体金试纸条对CL进行检测，试纸条具有含CL-BSA偶联物的检测线（T）和含羊抗鼠IgG多克隆抗体的对照线（C）。试纸条测试段浸有样液后CL金标单抗体在试纸条上发生层析泳动，接触T线后显红色，多余的CL金标单抗体继续泳动在C线接触显红色。CL阳性样本在TC线均显色，而阴性样本则只显示T线。通过T线值法和T/C比值法可以进行CL定量测定。GICA法具有操作简单、检测时间短、成本低廉的优势，适合长期的小批量检测活动，但特异性和灵敏度较差，胶体金需要达到107个/mm2才会形成明显的红色，市售检测卡灵敏度一般为3μg/L～5μg/L，略高于现行标准NY/T 933-2005《尿液中盐酸克仑特罗的测定胶体金免疫层析法》中CL判定限（3μg/L），因此存在一定的误判的可能性。张慧嫦等[12]用GICA检测猪肉等样品中CL并用EILSA复检时发现若降低检测限值则容易出现假阳性。张洪才等[13]建立的基于GICA的光电传感检测方法可利用光电传感器检测肉眼无法观测到的试纸条上的微量显色，并将检测限降低到0.05μg/L，在传统的GICA法上有着很大程度的改进。

2.5 时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）

TRFIA是一种新型的超微量非放射性标记免疫分析技术，利用镧系元素及其螯合物的的荧光性，以其代替传统的荧光物质、同位素等标记物对待测物进行检测。根据反应产物的荧光强度和相对荧光强度的比值进行待测物的浓度测定，稳定性强，灵敏度高。雷红涛等[14]以Eu3+标记抗原检测猪尿中CL的含量，最低检测限为0.03μg/L。樊晓博等[15]在此基础上进行优化，建立以Eu3+标记抗原的的直接竞争荧光免疫分析体系，检测猪尿中CL的灵敏度达到0.02μg/L，与沙丁胺醇等结构类似物交叉反应率小于1%，可有效地避免检测误差。

3 色谱分析法

3.1 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC是我国规定的克伦特罗的残留的半确证性检测的方法之一，其液相色谱分离系统由固定相（吸附剂）和流动相（溶剂）组成，由流动相携带待测物进入色谱柱后，待测物中各组分由于吸附性、分配系数等的差异而被分离。其在国家规定的HPLC标准方法中最低检出限为0.5μg/L，可作为较可靠的检测方法而采用。HPLC具有专属性好、速度快、检测精确度高、假阳性率低、检测前不需衍生化处理的优点，但所需仪器昂贵且检测过程繁琐，一般需要经过色谱柱净化前处理。HPLC适用于对不耐热或具极性的物质的检测，可以与质谱（MS）等系统联用。丁芳林等[16-17]检测猪肉中CL时使用体积比为甲醇∶水=26∶74的混合液作为流动相，在5min后即得到较理想的峰形，在此基础上加载液—液—液微萃取系统对含CL的猪尿进行检测时，其最低检出浓度可降低到0.025μg/mL，其检测灵敏度较以往的HPLC方法有更大的提高。

3.2 高效毛细管电泳法（HPCE）

HPCE是一种在高压直流电场下通过毛细管进行组分分离的液相分离技术。在电解质溶液中施加高压电场，使样本中不同组分由于淌度或分配的差异而通过毛细管实现分离。HPCE具有高效、快速、少样、简便等的优点。张敬敬等[18]在4min内实现CL、莱克多巴胺、沙丁胺醇的分离，加标回收率为89.20%～95.34%，相关系数达到0.997 1。李金祥等[19]将CL在2min内分离，最低检出限为0.5mg/L，加标回收率达到86.0%～94.0%。赵凌国等[20]采用对毛细管内壁进行纳米金材料（QC-Au NPs）的动态涂层，CL的最低检出限为0.06μg/mL，定量限为0.20μg/mL。

4 色谱-质谱串联法

4.1 气相色谱-质谱法（GC-MS）

GC-MS是将气相色谱法与质谱法联用的检测手段，以稳压恒速的气体作为流动相，与气化的样品混合带入色谱柱进行分离，再将试样中各组分在离子源中电离并进行质量分析得到质谱图确定被检物的质量。国家标准规定的GC-MS的检出限为0.5μg/L，但由于其系统优化后的检测限可达到0.02μg/L，相对于HPLC而言灵敏度更高。因检测前需对待测物质进行衍生化，导致耗时加长，对预处理要求更高。目前一般应用于筛选后阳性样品尤其集中于对动物尿液的确证分析，衍生化试剂一般采用双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、甲基三氯硅烷（MTS）等硅烷化试剂。康笑枫等[21]利用GC-MS对猪肉中CL进行检测时加入乙氰进行衍生，改善色谱行为并提高检测灵敏度，加标回收率为99.56%～105.40%。吴银良等[22]建立乙酸乙酯提取-稀盐酸反萃取-乙酸乙酯再反萃取相结合的方法，进行GC-MS测定时加标回收率为79.1%～95.7%。

4.2 高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）

HPLC-MS法的检测原理与GC-MS基本相同，但使用的流动相为液体。具有可分析物质类型多、检测限低、分离能力强、前处理无需衍生化、耗时较短的优点。在国家规定的HPLC-MS方法中的检出限为0.5μg/L，与GC-MS一致。陈海玲等[23]对猪尿中的CL和莱克多巴胺同时进行测定，样品中各组分分离较好，CL的加标回收率为69.2%～76.2%。吴庆洁等[24]对51份猪肉、鸡肉等畜禽肌肉样本进行CL的残留检测，最低检出量达到1.25 ng/μL。朱晓艾等[25]优化了其前处理方法，采用乙酸铵溶液提取、蛋白质沉淀的方法，加标回收率提高到88.5%～94.03%，在稳定性试验中24 h内出峰稳定。

4.3 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-质谱法（UHPLC-Q-TOF-MS）

UHPLC-Q-TOF-MS法是在近年才应用于检测CL的一种新型的检测方法，相关研究报道较少。相对高效液相色谱，UHPLC-Q-TOF-MS具有更强的分离能力和灵敏度，结合垫子喷雾离子源高分辨飞行时间质谱可精确测定待测物质的质量数，推算其分子式[26]。蒋万枫等[27]对猪肉样本中CL进行加标回收实验，分别添加0.5、2.0、5.0、10.0μg/kg的混标溶液，回收率为100%～110%，相对标准偏差为8.8%～18.5%。

4.4 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）

LC-MS/MS是将液相色谱-质谱法（LC-MS）与质谱检测系统进一步联用的一种检测方法。通过使LCMS检测系统中的待测物质的母离子进一步裂解，从而得到更精确的待测物质的质谱信息。LC-MS/MS兼备液相色谱的分离能力强和质谱的可分析物质结构的优点，精确度好、灵敏度高、线性范围广，在农业部1025号公告-18-2008国家标准所规定的LC-MS/MS方法的猪肉中CL的检测限为0.25μg/L，定量限为0.5μg/L，在实际检测中其对于CL的检出结果可信度较高。黄艳梅等[29]利用LC-MS/MS参照常规方法进行前处理，对猪肉中9种β-受动剂进行同时测定，结果显示其相对标准偏差为0.97%～11.53%，回收率为88.31%～118.61%。陈国等[30]测定猪肉中的CL单一对映体和手性对映体时，使用手性色谱柱进行拆分，检测得到的相关系数分别为0.997 7和0.977 0。

5 生物传感器技术（BS）

BS是一种新兴的浓度测定的技术，可感应待测物浓度并将数值转换成电信号输出，从而实现对待测物的检测。当分子识别元件与被识别物质接触时，由于化学和物理信号的产生（免疫反应、产生荧光、散发热量等），利用电学测量方法可接受信号并进行转换输出，最低检出限为0.1μg/L。BS具有高速、简便、灵敏、廉价、便携、可重复利用等特点，可实现现场检测和在线监测，能在短时间内分析大量待测分子[30-31]。PizaarielloA等首先报道了应用BS进行CL的检测。肖红玉等[32-33]对CL进行检测时建立的免疫生物传感器，可在20min内完成检测，准确度高达97%。在后续研究中肖红玉等发现，进行CL检测的过程中采用双酶（葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶）体系比采用单酶（葡萄糖氧化酶）体系更为灵敏，前者灵敏度大约为后者的两倍。

6 其他检测方法

近年来利用CdTe量子点免疫技术进行CL检测的研究正在开展，已研发出基于GICA原理而发展的CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析法，以CdTe/ZnSe核壳量子点作为标记物，代替胶体金对抗克伦特罗多克隆抗体进行标记[34]。胡华军等[35]报道了其对CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条的研制并将试纸条应用于对CL的检测。研究表明，此免疫层析试纸条的CL检测灵敏度可达1μg/L，且特异性较强，不与莱克多巴胺、西马特罗、沙丁胺醇、特布他林发生交叉反应。

光学表面等离子共振检测技术在生化、医学等领域具有较大的的应用前景，其检测CL的原理是利用非扫描性光学SPR生物传感器检测附着在金膜表面的CL的质量，将光束以一定角度射入，使表面等离子波产生共振，将CL固定在共振时反射光信号最弱的部位，通过竞争免疫分析测定其物质的量的变化而测定CL的含量。李会芹等[36]利用此技术测定猪肉中CL含量时，将10.198 2 g肉样用20mL 0.1mol/L高氯酸匀浆处理后进行检测，获得的相应信号与CL含量的相关系数达到0.997，其最低检出限为1.25mg/L。

7 展望

目前克伦特罗的检测的技术正日趋精确化、简便化、廉价化，但一般不能同时兼备迅速、准确、廉价、高通量等优点。当下的研究方向更倾向于提高精确度、缩短检测时长、检测设备的简易化，这种趋势在免疫检测技术与色相检测技术的发展、生物传感器以及采用新型标记物的试纸条的研制等最新的检测技术的不断应用上的体现尤为明显。与此同时，随着畜牧业的发展，在实际应用中需要高通量的新型中大型设备进行快速筛查。因此在今后的发展中，便捷的现场检测与先进的仪器确证方法相结合的方式会运用的更加广泛。

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Research Progress of Detection Methods of Clenbuterol Hydrochloride

WU Xiao-hong1，XING Lei2，NIE Wan1，CHEN Qiu-ling1，WANG Cheng-wei1，*
（1.College of Life Science，Jiangxi Science&Technology Normal University，Nanchang 330013，Jiangxi，China；2.Jiangxi Province Institute of Veterinary and Feed Control，Nanchang330029，Jiangxi，China）

This paper was reviewed some progresses in the detection method of clenbuterol hydrochloride and the characteristics of various detection methods were discussed，besides，prospected the research foreground of the detection method of clenbuterol hydrochloride，expecting this reserch finding had a certain referense value for the livestock product safety test.

animal products；clenbuterol hydrochloride；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.048

2016-05-28

江西科技师范大学第九届本科生创业、科研基金项目（20150901008）

伍晓红（1994—），女（汉），本科生，生物科学专业。