红藻氨酸致癫痫大鼠脑内炎症反应的研究

鲁建华

作者单位：湖北省咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院 神经内科 437000

红藻氨酸致癫痫大鼠脑内炎症反应的研究

鲁建华

作者单位：湖北省咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院 神经内科 437000

目的 通过观察大鼠痫性发作后血清和脑脊液中炎症因子白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)水平的动态变化，进而探讨炎症反应与癫痫的关系。方法 侧脑室注射红藻氨酸(Kainic acid，KA)建立颞叶癫痫大鼠动物模型，用ELISA方法测定大鼠痫性发作后6小时、24小时、72小时、1周血清和脑脊液中IL-6的水平，并与对照组相比较。同时观察癫痫发作后神经元的病理变化。结果 血清和脑脊液中IL-6水平在癫痫发作后6小时逐渐增加，24小时达高峰，以后逐渐下降。致痫24小时后出现大量神经元坏死。结论 炎症反应参与了癫痫后神经元损伤。IL-6或许可作为癫痫脑损伤后的早期外周生化标志物。

红藻氨酸 癫痫 炎症反应 IL-6

癫痫(epilepsy，EP)是一种严重危害人类健康的常见病、多发病。炎症与癫痫的关系近几年来受到较大关注。目前越来越多的证据显示炎性反应和炎性介质在癫痫形成过程中发挥着重要作用，炎症反应在一定程度上决定着癫痫的发生、发展[1]。癫痫发作能引起脑内细胞因子表达增高，炎症因子被认为与癫痫的发生频率、神经元的存活及胶质细胞的增生密切相关。IL-6是一种重要的炎性细胞因子，广泛参与中枢神经系统的免疫反应。本实验利用侧脑室注射红藻氨酸建立大鼠癫痫模型，通过动态观察癫痫发作后血清和脑脊液中IL-6水平的变化以及致痫后海马神经元的病理改变，进而探讨炎症反应与癫痫间的关系。

1.材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，体重250～300g，动物被随机分成对照组(6只)和模型组(24只)，模型组再随机分为癫痫发作后6小时、24小时、72小时、1周共4组，每组6只。对照组用等体积生理盐水代替KA行侧脑室注射。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制作:大鼠麻醉后，将大鼠头部仰卧位固定在立体定向仪上，头局部备皮、消毒，暴露前囟。按照大鼠脑立体定向图谱定位侧脑室：前囟后0.8mm，右侧旁开1.5mm，深度达硬脑膜表面。将预先装有KA的微量注射器沿钻孔进针，向侧脑室内注射1μg/μlKA溶液lμl，在10分钟内缓慢匀速注射，5分钟后拔除穿刺针。最后，用骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮，放回笼中，观察行为学。按Racine分级判断癫痫发作程度，Ⅲ级以上为造模成功。

1.2.2 血清和脑脊液标本采集：实验组大鼠在KA注射致痫后6小时、24小时、72小时、1周抽取血液和脑脊液。对照组大鼠注射生理盐水24小时后取血和脑脊液。脑脊液经枕大孔直接穿刺法采集大鼠脑脊液。每只大鼠采心脏血2.5ml。所有标本在室温下以3000r/min离心20分钟，取上清液置-20℃冰箱内保存待测。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清及脑脊液中IL-6水平：美国RD公司ELISA试剂盒，采用双抗体夹心法测定大鼠血清和脑脊液中IL-6水平。严格按照试剂盒说明书的步骤规范操作。

1.2.4 Nissl染色及神经细胞计数：取癫痫后不同时间点大鼠脑组织(背侧海马)经石蜡包埋后作冠状切片，片厚4μm。石蜡切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，蒸馏水浸洗3分钟；置于1%甲苯胺蓝染液，60℃温箱内浸染40分钟；蒸馏水漂洗3分钟后，置于70%酒精脱水1分钟；95%酒精分色：光镜下控制时间，约3～5分钟，直至尼氏体呈深蓝色，背景透明为止；无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。每组Nissl染色切片在海马CA3区随机各取5个200倍视野观察坏死神经元并计数。

2.结果

2.1 癫痫发作后各时间点血清和脑脊液中IL-6水平的动态变化 ①实验组大鼠致痫后，血清IL-6水平在6小时开始升高，24小时达峰值，以后逐渐降低，与对照组比较，致痫后24小时、72小时组IL-6水平均显著升高 (P<0.01)；②脑脊液IL-6水平在致痫后6小时也开始升高，24小时达峰值，以后逐渐降低，与对照组比较，致痫后24小时、72小时组IL-6水平显著升高(P<0.01)；③癫痫大鼠脑脊液和血清中的IL-6水平呈明显的正性相关，相关系数为0.978 (P<0.01) (见表1)。

组别血清脑脊液对照组7.63±0.4010.01±0.866小时组59.54±3.82*76.87±5.85*24小时组125.75±7.43*151.32±7.88*72小时组75.80±4.62*108.73±6.02*1周组47.53±2.17*63.16±4.75*

注：与对照组比较，*P<0.01，△P<0.05。

2.2 Nissl染色 对照组海马锥体细胞排列整齐，核仁居中，胞质内见蓝色斑块状或颗粒状的尼氏体；癫痫后6小时，CA3区神经元细胞肿胀、变圆，胞浆染色深浅不一；致痫后24小时，CA3区锥体细胞层次减少，排列稀疏，尼氏体减少，核仁模糊；致痫后72小时～1周，CA3区出现大量的坏死神经元，细胞层次不清，胞体萎缩，尼氏体消失(见图1)。

图1 Nissl染色示KA注射后海马CA3区；N-C依次为正常对照组，癫痫后6h、2h、1w组(200×)

2.3 海马CA3区坏死神经元的动态变化 各组Nissl染色切片在海马CA3区随机各取5个200倍视野观察并计数其均数，结果发现致痫后早期(24小时内)，CA3区神经元以肿胀、变性为主，未见明显神经元细胞坏死；致痫后24小时，CA3区锥体细胞层次明显减少，出现坏死神经元，表现为神经元核固缩，胞体缩小变形，胞浆尼氏小体消失，随时间推移，致痫后72小时～1周，坏死神经元逐渐增多(见表2)。

分组24小时组72小时组1周组CA3区6.2±0.710.8±1.3△13.6±2.2*

注：与24小时组比较，△P<0.05，﹡P<0.01。

3.讨论

目前普遍认为神经免疫调节失衡是促进癫痫发生发展的重要原因之一[2]。1969年Walker首先提出，细胞因子(cytokines，CKs)是神经-免疫-内分泌网络信息交流的关键环节。神经胶质细胞和神经元细胞分泌的多种CKs，如IL-1β，IL-2，IL-6，肿瘤坏死因子(TNF-α)等与其受体结合后导致中枢神经系统兴奋性发生改变，参与癫痫的病理过程。

正常情况下，脑组织不表达或低水平表达细胞因子，而KA致兴奋性毒性损伤后，活化的胶质细胞可分泌大量的炎性细胞因子，通过受损的血脑屏障进入血液中。IL-6是由淋巴细胞及非淋巴细胞(如星形胶质细胞和小胶质细胞)等产生的具有多种生物学功能的细胞因子，是参与细胞调节、炎性反应的重要细胞因子。IL-6对神经系统发挥神经营养及神经毒性双重作用。正常神经细胞表达低密度的IL-6，有中枢免疫介导和神经修复等生理作用；癫痫后，脑内的炎性细胞因子显著升高，如IL-1β，TNF-α和IL-6均在癫痫发作后迅速增加[3]。我们的研究结果显示，血清和脑脊液中IL-6水平在大鼠侧脑室注射KA致痫后6小时均出现升高(P<0.01)，24小时达高峰(P<0.01)，随后逐渐减低。两者呈现出明显的正性相关，相关系数为0.978 (P<0.01)，说明癫痫发作后早期脑内即存在炎症反应及血脑屏障破坏。癫痫后血清和脑脊液中的IL-6水平增高可能与胶质细胞的活化以及血脑屏障的破坏有关[4]。其机理可能是与炎症相关联的细胞因子多由胶质细胞分泌产生，KA致癫痫后伴随神经元的损伤胶质细胞早期激活，活化的胶质细胞可分泌包括IL-6在内的大量细胞因子，并能通过受损的血-脑屏障进入血液中，启动脑内甚至全身的炎性免疫应答，影响癫痫的进一步发生和发展以及调节神经元的活动。

胶质细胞的激活和细胞因子的上调可导致海马锥体细胞的病理改变，包括神经元死亡及反应性胶质增生[5]。Nissl染色主要用于石蜡或冰冻切片神经元细胞浆中的尼氏小体(Nissl body)染色。Nissl小体大而数量多，说明神经细胞合成蛋白质的功能较强，相反在神经细胞受到损伤时，Nissl小体的数量会减少。我们通过神经元的这一特异性染色，观察到大鼠致痫后神经元细胞损伤的动态变化。致痫后早期 (24小时内)，CA3区神经元出现变性、水肿，而致痫24小时后，出现神经元显著坏死，并随时间推移而增多。这表明胶质细胞活化是脑内炎症反应机制中的重要环节，作为细胞因子主要来源的胶质细胞在癫痫早期释放大量的炎性细胞因子，启动脑内炎症反应，影响癫痫的发生与发展，进而调节神经元的活动。

我们的实验结果提示，癫痫大鼠脑内存在急性炎症反应，这种炎症反应可能参与了癫痫发生及癫痫所致的脑损伤，涉及到胶质细胞的活化、炎症因子表达及神经元死亡。IL-6或许可作为癫痫脑损伤后的早期外周生化标志物。

1 LERNER-NATOLI M.Inflammation，angiogenesis and epilepsy[J].Biol Aujourdhui，2011，205(1):33-41.

2 VEZZANI A，FRIEDMAN A，DINGLEDINE RJ.The role of inflammation in epileptogenesis[J].Neuropharmacology，2013，69:16-24.

3 ULUDAG IF，DUKSAL T，TIFTIKCIOGLU BI，et al.IL-1β，IL-6 and IL1Ra levels in temporal lobe epilepsy[J].Seizure，2015，26:22-25.

4 VAN VLIET EA，ARONICA E，GORTER JA.Blood-brain barrier dysfunction，seizures and epilepsy[J].Semin Cell Dev Biol，2015，38:26-34.

5 GAO F，GAO Y，ZHANG S J，et al.Alteration of plasma cytokines in patients with active epilepsy[J].Acta Neurologica Scandinavica，2016，Sep 4.doi:10.1111/ane.12665.

Study on inflammation in kainic acid-induced epileptic rat

(LUJianhua.

XianningCentralHospital,Xianning437000,China.)

Objectives To investigate the levels of IL-6 in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of rats with epilepsy，and then to approach the relationship between inflammatory and epilepsy.Methods An animal model of epilepsy was established in Male SD rat by intracerebroventricular injection of KA.The levels of IL-6 in serum and CSF was measured by ELISA at 4 different time points—6，24，72 hours and 1 week after seizures.And control group were set up to be contrasted and be observed.At the same time,the pathological changes of neuron were observed after seizures.Results In the experimental group，levels of IL-6 protein in both serum and CSF increased gradually 6 hours after seizures and declined gradually after reaching their highest level at the 24 hour time point.A large amount of of neuron necrosis in hippocampus appeared at 24 hours after seizures.Conclusion Inflammatory reaction maybe involve in seizure-induced brain damage.IL-6 may be a key biomarker for predicting early seizure-induced neuron damage and necrosis.

kainic acid, epilepsy, inflammatory, IL-6

鲁建华，主治医师，硕士研究生，主要从事癫痫、帕金森方面研究。

10.3969/j.issn.1672-4860.2017.01.006

2016-12-22