染料木素对尿毒症大鼠细胞外基质沉积的影响

王 浩，冯 冰△，朱 超，于建平，黄宝砖

(1.解放军第四一一医院肾内科，上海 200081；2.第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433；3.上海市徐汇区中心医院肾内科 200031)

染料木素对尿毒症大鼠细胞外基质沉积的影响

王 浩1，冯 冰1△，朱 超1，于建平2，黄宝砖3

(1.解放军第四一一医院肾内科，上海 200081；2.第二军医大学长海医院肾内科，上海 200433；3.上海市徐汇区中心医院肾内科 200031)

目的 探讨染料木素对尿毒症大鼠细胞外基质(ECM)沉积的影响及其机制。方法 5/6肾切除术建立尿毒症模型鼠，将模型鼠分为染料木素组(G组)和对照组(C组)，假手术组(S组)作为正常对照。检测各组术前及术后第4、8周尿蛋白和生化等指标，第8周观察肾组织病理变化情况，半定量法评估肾小球硬化指数(GSI)。免疫组化法检测Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)的沉积情况。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、Western blot法分别检测肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1) mRNA转录、蛋白质表达情况。结果 术后第4周与C组比较，G组尿蛋白排泄量减少[(11.63±2.07)vs. (19.93±3.19)mg/d，P<0.01]，血清尿素氮、肌酐水平降低[(9.39±0.59)vs.(12.09±0.78)mmol/L，(65.11±3.79)vs.(77.63±3.20)μmol/L，P<0.01]。至术后第8周，尿蛋白排泄量减少，血清尿素氮、肌酐水平降低更为显著。肾小球内ColⅣ和FN沉积减少[(17.30±1.96)%vs. (24.68±3.97)%,(18.26±2.31)%vs. (29.35±4.15)%，P<0.01]，肾小球硬化明显减轻。TGF-β1mRNA、蛋白质表达减弱(P<0.05)。结论 染料木素可以减少尿毒症大鼠细胞ECM的蓄积，对肾脏具有保护作用。

染料木素；尿毒症；大鼠,Sprague-Dawley；胶原Ⅳ型；纤维连接蛋白；转化生长因子β1

大豆为豆科植物大豆的成熟种子，我国最早的本草著作《神农本草经》首次记载了大豆及其药用价值，并将其列为中品。大豆异黄酮(soybean isoflavone)是存在于大豆中的生物活性物质，主要包括染料木素(genistein)、大豆甙元(daidzein)、大豆苷元(glycitein)等。有研究证实，大豆蛋白饮食可以减轻肾小球纤维化、降低蛋白尿、减轻肾小管萎缩[1-3]。国内亦有研究发现，大豆蛋白饮食可以减轻尿毒症大鼠的早期血管病变，对肾脏具有一定的保护作用[4]。目前有关大豆蛋白几种活性成分的研究主要集中在细胞与分子水平上，动物实验研究相对较少。本研究以5/6肾切除建立尿毒症大鼠模型，观察染料木素对肾硬化鼠细胞外基质(ECM)的作用情况。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：雌性6周龄清洁级SD大鼠[动物许可证号SCXK-(沪)2007-0003] 25只，体质量200～230 g，饲养于第二军医大学药学院院清洁级动物房(合格证号：医动字第02-64号)。温度20～23 ℃，相对湿度40%～50%，光照12 h明暗交替，标准饲料饲养，自由饮水。(2)主要试剂：染料木素(批号：G6649-70)、兔抗大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)、兔抗大鼠纤维连接蛋白(FN)抗体购于Sigma公司，小鼠抗大鼠转化生长因子β1(TGF-β1)抗体、羊抗小鼠二抗购于DAKO公司，ECL试剂盒购于Pierce公司，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂购于Promega公司。(3)主要仪器：SYNCHRON CX5全自动生化分析仪购于Beckman公司，Thermal Cycler 480 PCR仪购于Perkin Elmer公司，HPIAS-1000型医学图像分析系统购于千屏影像工程公司，GDS 7500凝胶成像分析系统购于美国UVI公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 使用数字表法，随机将25只大鼠分为3组：假手术组(S组)8只，对照组(C组)8只，染料木素组(G组)9只。

1.2.2 尿毒症模型鼠的建立及饲养方案 C、G组大鼠采用间隔1周的两步法建立5/6肾切除尿毒症模型鼠[5]，1期手术在麻醉下扇形切除左肾上下极各1/3，吸收性明胶海绵止血；术后第8天行2期手术摘除右肾。S组麻醉下仅打开左、右肾包膜，不切除肾脏。术后各组正常饮食喂养8周，G组于2期手术后次日给予染料木素15 mg/(kg·d)灌胃；C组予等量的生理盐水灌胃。

1.2.3 尿蛋白及血生化检测 术前及术后第4、8周各组大鼠禁饮1 d，于代谢笼中收集24 h尿液，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定尿蛋白量。于同样的时间点，各组大鼠禁食12 h后经内眦静脉取血，检测血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、血清清蛋白(Alb)和血清总蛋白(TP)。

1.2.4 肾组织病理检查 2期手术后第8周采血检测Scr和BUN，确认尿毒症模型成功建立后即处死大鼠。手术摘取残肾，固定、包埋、切片，行HE染色。在光镜下观察各组肾小球病理情况。Raij半定量法[6]评估肾小球硬化指数(GSI)。肾小球出现玻璃样变和(或)毛细血管塌陷则定义为硬化。根据硬化灶所占肾小球比例分为0～++++：肾小球无硬化为0；受损0～<25%为+；受损25%～<50%为++；受损50%～<75%为+++，受损75%～100%为++++。每张切片观察30个以上的肾小球，计算GSI。

1.2.5 免疫组织化学检测 应用SABC法测定残肾组织中的ColⅣ和FN。肾组织切片、脱蜡，PBS冲洗3 min，3%H2O2抑制内源性过氧化物酶30 min，微波加热后行抗原修复，PBS冲洗5 min，分别加入一抗、二抗，DAB显色，光镜下棕黄色的颗粒为阳性显示。各鼠随机选取10个肾小球，应用HPIAS-1000型医学图像分析系统计算图像中阳性区域与全区域的面积比。

1.2.6 RT-PCR法检测TGF-β1mRNA表达 取肾皮质30～50 mg，Trizol法抽提总RNA，逆转录合成cDNA。TGF-β1引物序列上游：5′-CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG A-3′，下游：5′-CCT CGT CAA CAG GTT GTA CTA GCA C-3′，扩增产物大小为298 bp；GAPDH引物序列上游：5′-TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATG-3′，下游：5′-GTG GCA GTG ATG GCA TGG ATC-3′，扩增产物大小为443 bp。PCR扩增条件：94 ℃变性 1 min，55 ℃ 退火1 min 30 s，72 ℃ 延伸1 min 30 s，共40个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，GDS 7500分析系统进行定量分析。

1.2.7 Western blot 印迹分析 取30～50 mg肾皮质碾碎，加入0.5 mL含PMSF的细胞裂解液，置冰上超声细胞粉碎。5 000 r/min，0 ℃离心后取上清液。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，分离后电转移至硝酸纤维素膜，置于5%脱脂奶粉中封闭1 h。将NC膜放入小鼠抗大鼠TGF-β1稀释液中孵育16 h，漂洗。加入羊抗小鼠IgG中孵育2 h。利用ECL试剂盒对产物进行检测。GDS 7500分析系统检测各条带的光密度。

2 结 果

2.1 各组大鼠尿蛋白水平及血生化指标比较 手术后第4周，C组大鼠尿蛋白及Scr、Bun水平均升高，第8周时明显升高。与C组比较，S、G组尿蛋白排泄量明显减少(P<0.01)，Scr、Bun水平均显著下降(P<0.01)。实验期间各组大鼠血清Alb及TP水平比较均差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠肾脏病理检查比较 在光镜下，S组(图1A)肾小球结构清晰，无系膜增生、细胞增殖；C组(图1B、C)肾小球肥大、结构紊乱，呈局灶纤维化或弥漫性球性硬化，血管襻内皮细胞增殖，肾间质可见炎细胞浸润，动脉管腔轻度狭窄；G组(图1D)肾小球肥大不明显，细胞增殖、系膜区增宽亦不及C组显著。S、C、G组大鼠GSI分别为3.34±2.62、42.38±14.31、27.65±7.23。与C组比较，G组大鼠GSI明显降低(P<0.01)。

2.3 各组大鼠肾脏组织FN 和Col Ⅳ表达水平比较 结果表明，S组肾小球系膜区有少量的ColⅣ和FN沉积。C组ColⅣ和FN沉积明显增加(P<0.01)。与C组相比，G组ColⅣ和FN沉积明显减少(P<0.01)，见图2、表2。

表1 不同时间点各组大鼠尿蛋白量及生化指标比较

a：P<0.01，与S组比较；b：P<0.01，与C组同期比较。

A：S组；B、C：C组；D： G组。

图1 各组大鼠肾组织HE染色(HE×200)

A：S组FN表达；B：G组FN表达；C：C组FN表达；D：S组Col Ⅳ表达；E：G组Col Ⅳ表达；F：C组Col Ⅳ表达。

图2 各组大鼠肾组织FN 和Col Ⅳ表达(HE×200)

a：P<0.01，与S组比较；b：P<0.01，与C组比较。

2.4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1mRNA及蛋白表达比较 C组肾组织TGF-β1mRNA及蛋白表达较S组升高(P<0.05)，G组肾组织TGF-β1mRNA及蛋白表达较C组降低(P<0.05)，见图3、4及表3。

图3 各组大鼠肾脏组织 TGF-β1 mRNA表达

图4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1蛋白表达

组别nTGF-β1mRNATGF-β1蛋白S组80.132±0.0320.127±0.037C组80.644±0.079a1.405±0.131aG组90.329±0.055b0.432±0.076b

a：P<0.05，与S组比较；b：P<0.05，与C组比较。

3 讨 论

慢性肾脏病的医学营养治疗由来已久，但是关于是否可以食用大豆蛋白的争议一直困扰着临床医生和患者。传统观念认为，大豆蛋白由于非必需氨基酸的存在，加重了肾脏的负担，可能不利于甚至加重肾病患者的病情。但近年来，越来越多的研究表明，大豆蛋白饮食可以减轻多种肾病的肾脏损害。Javanbakht等[7]通过对肾病综合征鼠模型的研究发现，大豆蛋白可以改善肾组织氧化应激、减轻肾实质损害。Ibrahim等[8]发现，大豆蛋白可以降低多囊模型鼠的蛋白尿、改善酸中毒、减轻肾硬化。Yang等[9]研究证实大豆蛋白可以降低5/6肾次全切大鼠残余肾组织 TNF-α水平、抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性、减缓肾衰竭。而作为大豆蛋白单独的一种活性成分，染料木素也已被证实可以减少糖尿病模型鼠的蛋白尿、降低SCr和BUN、改善脂质堆积[10]，对肾脏具有保护作用。

本实验以5/6肾切除建立尿毒症鼠模型，观察染料木素对ECM的作用情况。研究发现，在实验的第4周，C组尿SCr、BUN升高，尿蛋白排泄量增加；第8周时，SCr、BUN升高更为明显。G组前述指标在第4和第8周时均明显低于C组，残肾组织病理改变亦明显减轻。结果表明染料木素可以减轻尿毒症鼠的肾损伤。全段实验过程中，各组间血清Alb及TP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，分析其原因可能是虽然尿蛋白排泄量增加，但肝脏尚能代偿，故血清Alb及TP水平没有明显降低。

ECM主要由ColⅣ、FN、ColⅠ、ColⅤ型和层粘连蛋白等组成。ColⅣ为基底膜胶原蛋白，主要分布于肾小球、肾小管基底膜以及系膜基质之中。FN是一种糖蛋白，由肾小球固有细胞分泌。目前普遍认为，ECM动态平衡的失调介导了肾小球硬化的发生、发展。特别是ColⅣ和FN，其代谢失衡过程可能参与了肾小球损伤及修复过程中的组织重塑[11]。现已认识到，肾脏正常组织的逐渐纤维化是大多数慢性肾衰竭进行性发展的共同病理基础。如能有效地阻止或减缓肾组织纤维化的发展，对延缓或改善慢性肾衰具有非常重要的意义。在本实验中，G组与C组相比，ColⅣ和FN在基底膜和系膜区的沉积明显减少。表明染料木素可以减少尿毒症鼠ECM的蓄积，减缓肾小球硬化。

TGF-β1是一类超家族细胞因子，作用广泛，参与了体内诸如炎症、血管形成、组织发生、增生、凋亡等多种生物学过程[12-13]，尤其是在ECM的产生和调控方面意义重大。Meng等[14]认为，正常或仅有微小病变的肾脏中，TGF-β1表达非常微弱。当出现肾损害时，TGF-β1表达明显增强。通过抑制TGF-β1表达，可以减轻肾脏纤维化、维护正常的肾脏功能、保护残余肾功能[15]。本实验中，G组TGF-β1在mRNA、蛋白质水平上与C组比较均明显减弱，提示TGF-β1的过度表达可能参与了肾组织间质纤维化的过程，并最终导致慢性肾衰竭。而染料木素有对TGF-β1的表达有抑制作用，该结果与尿蛋白排泄量、血生化、肾组织病理学改变、ColⅣ和FN的沉积情况等相一致。

综上所述，染料木素可以降低ColⅣ、FN等ECM的蓄积、减轻肾小球硬化，对尿毒症鼠具有一定的肾脏保护作用，其机制可能与下调TGF-β1表达有关。

[1]Javanbakht MH,Sadria R,Djalali M,et al.Soy protein and genistein improves renal antioxidant status in experimental nephrotic syndrome[J].Nefrologia,2014,34(4):483-490.

[2]Maditz KH,Gigliotti JC,Tou JC.Evidence for a role of proteins,lipids,and phytochemicals in the prevention of polycystic kidney disease progression and severity[J].Nutr Rev,2013,71(12):802-814.

[3]Miraghajani MS,Esmaillzadeh A,Najafabadi MM,et al.Soy milk consumption,inflammation,coagulation,and oxidative stress among type 2 diabetic patients with nephropathy[J].Diabetes Care,2012,35(10):1981-1985.

[4]张志强，袁伟杰，叶菡洋，等．大豆蛋白饮食对5/6肾切除大鼠血管早期病变的影响[J]．中华肾脏病杂志，2007，23(8)：529-533．

[5]Kennedy DJ,Elkareh J,Shidyak A,et al.Partial nephrectomy as a model for uremic cardiomyopathy in the mouse[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(2):450-454.

[6]Raij L,Azar S,Keane W.Mesangial immune injury,hypertension,and progressive glomerular damage in Dahl rats[J].Kidney Int,1984,26(2):137-143.

[7]Javanbakht MH,Sadria R,Djalali M,et al.Soy protein and genistein improves renal antioxidant status in experimental nephrotic syndrome[J].Nefrologia,2014,34(4):483-490.

[8]Ibrahim NH,Jia Y,Devassy JG,et al.Renal cyclooxygenase and lipoxygenase products are altered in polycystic kidneys and by dietary soy protein and fish oil treatment in the Han:SPRD-Cy rat[J].Mol Nutr Food Res,2014,58(4):768-781.

[9]Yang HY,Chen JR,Chang LS.Effects of soy protein hydrolysate on blood pressure and angiotensin-converting enzyme activity in rats with chronic renal failure[J].Hypertens Res,2008,31(5):957-963.

[10]Elmarakby AA,Ibrahim AS,Faulkner J,et al.Tyrosine kinase inhibitor,genistein,reduces renal inflammation and injury in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Vascul Pharmacol,2011,55(5/6):149-156.

[11]Genovese F,Manresa AA,Leeming DJ,et al.The extracellular matrix in the kidney:a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2014,7(1):4-9.

[12]Liu RM,Desai LP.Reciprocal regulation of TGF-β and reactive oxygen species:a perverse cycle for fibrosis[J].Redox Biol,2015,12(6):565-577.

[13]Docherty NG,Murphy M,Martin F,et al.Targeting cellular drivers and counter-regulators of hyperglycaemia and TGF-β1-associated profibrotic responses in diabetic kidney disease[J].Exp Physiol,2014,99(9):1154-1162.

[14]Meng XM,Nikolic-Paterson DJ,Lan HY.TGF-β:the master regulator of fibrosis[J].Nat Rev Nephrol,2016,12(6):325-338.

Effect of genistein on deposition of extracellular matrix in uremic rats

WangHao1，FengBing1△，ZhuChao1，YuJianping2，HuangBaozhuan3

(1.DepartmentofNephrology，No. 411HospitalofPLA，Shanghai200081，China；2.DepartmentofNephrology，ChanghaiHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China；3.DepartmentofNephrology，XuhuiDistrictCentralHospital，Shanghai200031，China)

Objective To investigate the effect of genistein on deposition of extracellular matrix(ECM) in uremic rats and its mechanism.Methods The uremic rat model was established by 5/6 nephrectomy.The model rats were divided into the genistein group(G) and control group (C).The sham-operation group served as the normal control(S).Urinary protein and biochemical indexes before operation,at postoperative 4,8 weeks were measured in various groups.The pathologic changes of renal tissue were observed.The glomerular sclerosis index(GSI) was evaluated by the semi-quantitative method.fibronectin(FN) and type Ⅳcollagen(ColⅣ) deposition situation were detected by using the immunohistochemical method.Western blot and RT-PCR were used to measure the protein expression and mRNA transcription of TGF-β1.Results Comparing postoperative 4 weeks with the group C,the urinary protein excretion amount was decreased[(11.63±2.07)mg/dvs.(19.93±3.19)mg/d，allP<0.01],serum urea nitrogen and creatinine levels of the group G were decreased[(9.39±0.59)mmol/Lvs.(12.09±0.78)mmol/L，(65.11±3.79)mmol/Lvs.(77.63±3.20)μmol/L，allP<0.01].Until postoperative 8 weeks,the urinary protein excretion amount was decreased and the decrease of serum urea nitrogen and creatinine levels was more obvious.The deposition of ColⅣ and FN in renal glomerulus was lower than that of the control group[(17.30±1.96)%vs.(24.68±3.97)%;(18.26±2.31)%vs.(29.35±4.15)%,allP<0.01].Glomerular sclerosis was significantly alleviated.The TGF-β1mRNA and protein expression were attenuated (P<0.05).Conclusion Genistein can reduce the deposition of ECM in uremic rats and has a protective effect on kidney.

genistein;uremia;rats,Sprague-Dawley;collagen type Ⅳ;fibronectin;transforming growth factor beta1

� 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.005

王浩(1973-)，副主任医师，硕士研究生，主要从事肾脏病营养学研究。△

，E-mail:fengbing411snk@163.com。

R459.3

A

1671-8348(2017)07-0879-04

2016-08-12

2016-11-26)