NF-κB信号通路介导楤木皂甙抗宫颈癌作用及机制研究*

段海霞，李东红，暴 蕾，李 欢，高红敏

(陕西省西安市第四医院妇产科 710004)

NF-κB信号通路介导楤木皂甙抗宫颈癌作用及机制研究*

段海霞，李东红△，暴 蕾，李 欢，高红敏

(陕西省西安市第四医院妇产科 710004)

目的 探讨楤木皂苷对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和迁移的抑制作用，揭示核因子-κB(NF-κB)在楤木皂苷抑癌过程中的分子机制。方法 以体外培养的人宫颈癌细胞HeLa系为研究对象，实验分为对照组、楤木皂苷(200 μg/mL)处理组(观察组)，48 h后观察两组HeLa细胞增殖能力的改变。运用Western blot检测NF-κB的表达及酵母自噬基因Atg5/Vps30的同源基因(Beclin 1)、自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)的改变。结果 楤木皂苷能够显著抑制HeLa细胞的增殖；楤木皂苷能够抑制NF-κB信号通路及促进自噬相关蛋白Beclin 1、Atg 5、LC3B的表达。结论 楤木皂苷能够抑制NF-κB信号通路，进而诱导自噬的发生影响宫颈癌细胞HeLa的增殖和迁移。

宫颈肿瘤；楤木皂苷；自噬；NF-κB

宫颈癌(cervical cancer)是女性常见的恶性肿瘤，并具有较高的发病率和病死率[1]。其发病机制尚未明确，可能与高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papillomavirus，HR-HPV)的持续感染相关[2]。针对宫颈癌的治疗以手术结合放疗、化疗为主，但目前针对宫颈癌的治疗仍存在一定的局限性。因此，尽早找寻能够抑制宫颈癌发展的药物是当今相关领域的研究重点。

自噬是细胞程序性死亡的一种，也被称为二型程序性死亡，当细胞受到例如饥饿、病毒感染、外源性刺激、细胞内异常蛋白蓄积时就会诱导自噬的发生[3-4]。正常水平的自噬是维持细胞稳定的一种生理过程，然而过度的自噬则会引起细胞的死亡。核因子-κB(NF-κB)信号通路是抗肿瘤研究中较为重点的一条信号通路，作为一种核转录调控因子，广泛地参与免疫应激、生长分化、细胞增殖等生命活动[5-6]。楤木皂苷是我国重要的中药药材之一，具有保肝护肝、降血糖降血脂、抗氧化抗病毒等功能。有研究表明，楤木皂苷具有一定的抗肿瘤作用，本课题前期结果也证实楤木皂苷能够诱导HeLa细胞凋亡发生[7]。因此，研究楤木皂苷对宫颈癌的抑制作用具有一定的理论基础。另外研究、开发楤木皂甙的抗宫颈癌作用，将会为宫颈癌的生物学治疗提供更多理论基础和分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 HeLa细胞由西安交通大学医学院实验医学中心提供；楤木皂苷由西京医院药剂科提供；RPMI-1640培养基购自Invitrogen 公司；肌动蛋白(Actin)、酵母自噬基因Atg5/Vps30的同源基因(Beclin 1)、自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)和NF-κB抗体购自Abcam 公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amressco 公司；二甲基亚砜(DMSO)购自天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Hela细胞培养 常规条件培养Hela细胞，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件。

1.2.2 Hela细胞生长抑制及迁移的检测 实验分为对照组、楤木皂苷(200 μg/mL)处理组(观察组)。48 h后加入新配置的5 mg/mL的MTT 20 μL，继续放入孵箱4 h，弃去上清液后每孔加入150 μL的DMSO，震荡混匀。运用490 nm的酶标仪检测吸光度。

1.2.3 Western blot检测信号通路及自噬相关蛋白 收取蛋白样品，运用蛋白定量检测的方法测定蛋白水平。50 μg蛋白加入上样缓冲液后进行凝胶电泳，再电转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。孵育一抗和二抗，用化学发光法显色，曝光、显影、定影。以Actin作为内参照。条带用薄层扫描仪扫描，再运用软件分析各条带灰度值，计算各蛋白(Beclin 1、LC3B、NF-κb)的相对水平。

1.2.4 激活NF-κB信号通路对抑制自噬的发生及促进Hela细胞增殖的影响 运用NF-κB受体的激动因子(receptor activator of NF-kappa B ligand，RANKL)干预后(RANKL组)，与楤木皂苷共同处理(联合组)，并观察各组细胞NF-κB信号通路激活的情况。

2 结 果

2.1 两组Hela细胞增殖活力比较 MTT细胞增殖实验发现，观察组与对照组比较，细胞增殖活力显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 两组细胞自噬相关蛋白表达水平比较 运用Western blot检测了两组细胞自噬相关蛋白Beclin 1、Atg 5、LC3B的表达，结果发现，观察组能够显著促进自噬相关蛋白的水平，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

a：P<0.05，与对照组比较。

图1 两组Hela细胞增殖活力比较

a：P<0.05，与对照组比较。

图2 两组自噬相关蛋白表达水平比较

2.3 两组细胞NF-κB信号中p65蛋白表达比较 运用Western blot检测了NF-κB信号通路中p65蛋白的表达水平，结果显示观察组NF-κB信号通路处于抑制状态，与对照组比较，观察组p65蛋白受到抑制，见图3。

2.4 各组细胞自噬相关蛋白的表达比较 采用Western blot检测自噬相关蛋白的表达，激活NF-κB信号通路能够抑制自噬的发生及促进Hela细胞的增殖，运用RANKL干预后，能够引起NF-κb信号通路激活，结果发现，楤木皂苷诱导的Hela细胞自噬性死亡降低，促进自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3B的表达(图4)；自噬相关蛋白表达受到抑制，楤木皂苷引起的细胞增殖活力降低得到了逆转，见图5。

a：P<0.05，与对照组比较。

图3 两组细胞NF-κB信号中p65蛋白表达比较

1：对照组；2：观察组；3：RANKL组；4：联合组；a：P<0.05，与对照组比较，b：P<0.05，与观察组比较。

图4 Western blot 检测各组细胞自噬相关蛋白的表达

a：P<0.05，与对照组比较，b：P<0.05，与观察组比较。

图5 各组Hela细胞的增殖活力比较

3 讨 论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，并具有较高的发病率和病死率，每年约有20万妇女死于此病[7]。我国宫颈癌的发病率较高，其中西北地区该病的死亡率最高。其发病机制尚未明确，可能与HR-HPV的持续感染相关。宫颈癌的迁移与侵袭是该病治愈较难的主要原因，一些邻近器官均会受到癌细胞的侵蚀。目前针对宫颈癌的治疗主要以手术结合放、化疗为主。但均未有很好的疗效，因此寻找治疗宫颈癌的新药具有重要的意义。

楤木皂苷是我国重要的中药药材之一，具有保肝护肝、降血糖降血脂、抗氧化抗病毒等功能[8]。另有研究表明楤木皂苷具有一定的抗肿瘤作用，本课题前期结果也证实楤木皂苷能够诱导HeLa细胞凋亡发生[7]。因此，研究楤木皂苷对宫颈癌的抑制作用具有一定的理论基础。另外研究、开发楤木皂甙的抗宫颈癌作用，将会为宫颈癌的生物学治疗提供更多理论基础和分子靶点。

近年来研究发现，自噬作为程序性死亡的一种，在肿瘤细胞存活的命运中发挥着重要的作用，诸多抗肿瘤药物的作用机制均与自噬的发生相关[3]。当肿瘤细胞自噬过度发生后，能够促进肿瘤细胞的死亡[9]。本研究发现，楤木皂苷处理后能够显著促进自噬水平的升高。这种自噬水平的增高可能与楤木皂苷抑制Hela细胞的增殖和迁移相关。之前的研究表明，调控自噬发生的机制中，主要以mTOR信号通路为主。NF-κB信号通路与肿瘤的增殖和迁移关系密切[10-14]。RANKL是NF-κB信号通路的激动剂。在前期的研究结果中也发现，楤木皂苷能够抑制Akt/NF-κB信号通路的活性。NF-κB信号通路与自噬水平的增强存在一定的关联性。本研究运用NF-κB信号通路的激动剂后，观察Hela细胞自噬相关蛋白的改变，结果发现，当NF-κB信号通路被抑制后，自噬相关蛋白Beclin 1、LC3B水平降低。以上结果提示，NF-κB信号通路参与了楤木皂苷诱导的Hela细胞自噬性死亡。

综上所述，楤木皂苷对Hela细胞的抑制作用可能与促进其自噬的发生有关，并且自噬的发生受到了NF-κB信号通路的调控。楤木皂苷很可能会成为一种临床上治疗宫颈癌的有效药物。

[1]Basu S,Mahajan A.Psoas muscle metastasis from cervical carcinoma:Correlation and comparison of diagnostic features on FDG-PET/CT and diffusion-weighted MRI[J].World J Radiol,2014,6(4):125-129.

[2]Chen J,Giridhary KV,Zhang LY,et al.A protein kinase C/protein kinase D pathway protects LNCaP prostate cancer cells from phorbol ester-induced apoptosis by promoting ERK1/2 and NF-kappa B activities[J].Carcinogenesis,2011,32(8):1198-1206.

[3]Liu J,Fan L,Wang H,et al.Autophagy,a double-edged sword in anti-angiogenesis therapy[J].Med Oncol,2016,33(1):721-729.

[4]Zhang JB,Cao R,Cai TJ,et al.The role of autophagy dysregulation in Manganese-Induced dopaminergic neurodegeneration[J].Neurotox Res,2013,24(4):478-490.

[5]Gilmore TD.The Re1/NF-kappa B/I kappa B signal transduction pathway and cancer[J].Cancer Treat Res,2003,115(115):241-265.

[6]Tapia MA,González-Navarrete I,Dalmases A,et al.Inhibition of the canonical IKK/NF kappa B pathway sensitizes human cancer cells to doxorubicin[J].Cell Cycle,2007,6(18):2284-2292.

[7]Lee EB,Kim OJ,Kang SS,et al.Araloside a,an antiulcer constituent from the root bark of aralia elata[J].Biol Pharm Bull,2005,28(3):523-526.

[8]Kaur S,Sharma N,Krishn SR,et al.MUC4-mediated regulation of acute phase protein lipocalin 2 through HER2/AKT/NF-κB signaling in pancreatic cancer[J].Clin Cancer Res,2014,20(3):688-700.

[9]Shao LN,Zhu BS,Xing CG,et al.Effects of autophagy regulation of tumorassociated macrophages on radiosensitivity of colorectal cancer cells[J].Mol Med Rep,2016(13):2661-2670.

[10]Guo L,Yu H,Gu W,et al.Autophagy negatively regulates transmissible gastroenteritis virus replication[J].Sci Rep,2016,6(23864):1-14.

[11]Dong X,Levine B.Autophagy and viruses:adversaries or allies?[J].Innate Immun,2013,5(5):480-493.

[12]Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell,2008,132(1)：27-42.

[13]Levine B,Mizushima N,Virgin HW.Autophagy in immunity and inflammation[J].Nature,2011,469(7330):323-335.

[14]Zhang Y,Li Z,Ge X,et al.Autophagy promotes the replication of encepha- lomyocarditis virus in host cells[J].Autophagy,2011,7(6):613-628.

Research on anti-cervical cancer effect of araloside mediated by NF-kappa B signaling pathway and its mechanism*

DuanHaixia,LiDonghong△,BaoLei,LiHuan,GaoHongmin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,Xi′anMunicipalFourthPeople′sHospital,Xi′an,Shaanxi710004,China)

Objective To explore the inhibition role of araloside on cervical cancer HeLa cell proliferation and migration to reveal the molecular mechanism of NF-κB in HeLa cell in the process of tumor suppression.Methods The in vitro cultured cervical cancer HeLa cell line served as the research object.The experiment was divided into the control group and araloside(200 μg/mL) treatment group(observation group).The change of proliferation and migration ability after 48 h were observed in the two groups.Western blot was used to detect the expression of NF-κB molecule and change of autophagy involved protein Beclin 1 and LC3B.Results Araloside could significantly inhibit the proliferation and migration of HeLa cells and the NF-κB signaling pathway,and promoted the expression of autophagy related molecule Beclin 1，Atg 5 and LC3B.Conclusion Araloside could inhibit the NF-κB signaling pathways,thus induces autophagy occurrence and influences the proliferation and migration of cervical cancer HeLa cells.

uterine cervical neoplasms;araloside;autophagy;NF-kappa B

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.008

陕西省科学技术研究发展计划基金资助项目(2013K12-03-22)。 作者简介：段海霞(1983-)，主治医师，硕士研究生，主要从事宫颈癌的机制研究。△

，E-mail：lidonghong2014@126.com。

R737.33

A

1671-8348(2017)07-0889-03

2016-08-20

2016-11-03)