GLP-1R和CK17在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

曾 曦，陈 嘉，田 奕

(1.贵州医科大学附属医院核医学科，贵阳 550001；2.贵州医科大学安顺医院核医学科，贵州安顺 561000)

GLP-1R和CK17在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

曾 曦1，陈 嘉2，田 奕2

(1.贵州医科大学附属医院核医学科，贵阳 550001；2.贵州医科大学安顺医院核医学科，贵州安顺 561000)

目的 探讨甲状腺乳头状癌组织中胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)和细胞角蛋白17(CK17)的表达及临床病理意义。方法 采取免疫组织化学及免疫印迹法检测甲状腺正常组织(对照组，n=50)和甲状腺乳头状癌组织(观察组，n=80)中GLP-1R和CK17的表达，并分析二者水平与甲状腺乳头状癌病理因素间的相关性。结果 对照组中22例(44.00%)有GLP-1R蛋白低表达；观察组中77例(96.25%)有GLP-1R蛋白表达，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。对照组中有8例(16.00%)CK17表达阳性；观察组中CK17阳性表达有77例(96.25%)，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。GLP-1R的阳性表达与甲状腺乳头状癌的临床病理因素间差异无统计学意义(P>0.05)。CK17表达与甲状腺乳头状癌患者的性别、年龄无明显相关(P>0.05)，而与肿瘤的直径、临床分期及颈部淋巴结转移明显相关(P<0.05)。结论 甲状腺乳头状癌组织中GLP-1R和CK17均高表达， CK17表达与甲状腺乳头状癌的肿瘤直径、临床分期及颈部淋巴结转移明显相关。

甲状腺肿瘤；胰高血糖素样肽-1受体；细胞角蛋白17；免疫组织化学；免疫印迹法

甲状腺乳头状癌为甲状腺恶性肿瘤中最常见类型，据统计甲状腺乳头状癌约占整个甲状腺恶性肿瘤的80%[1]，近年甲状腺癌的患病率在世界范围内呈逐渐增加趋势，有文献报道甲状腺乳头状癌约占全身恶性肿瘤的1.00%～4.42%，已成为常见恶性肿瘤之一[2]。经淋巴转移是甲状腺乳头状癌的常见临床特点之一，约50%的患者在手术时常合并有淋巴结浸润[3-4]。目前，甲状腺乳头状癌的临床病理诊断以细胞核形态为主要特征，如核沟、毛玻璃样核及核内包涵体等；然而，临床实践中部分甲状腺良性病变，如结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎及滤泡性腺瘤等也常合并毛玻璃样核等病理改变，故给甲状腺乳头状癌的确诊产生难度[1]。本研究应用免疫组织化学和免疫印迹法检测胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptors，GLP1R)和细胞角蛋白17(cytokeratin17，CK17)在甲状腺乳头状癌组织中的表达，分析二者阳性水平与甲状腺乳头状癌的病理因素间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取贵州医科大学附属医院2013年3月至2015年9月收集的100例甲状腺乳头状癌患者病理标本100份(观察组)，其中男16例，女84例；年龄39～61岁，平均(50.58±7.61)岁。将100份标本分为2部分，其中80份用于免疫组织化学和临床研究，男12例，女68例；年龄39～60岁，平均(50.26±7.78)岁。所有病例均为首次手术，术前均未接受任何化学治疗和放射治疗，参照WHO肿瘤学分类[5]标准均为甲状腺乳头状癌，临床资料完整。TNM分期参照2002年国际抗癌联盟(UICC)制定的标准进行[6]，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例；肿瘤直径：>1 cm者51例，≤1 cm者29例；经病理检查合并颈部转移34例，无颈部转移46例。20份标本用于免疫印迹检测。另选择经病理检查证实为正常甲状腺组织60例为对照组，男10例，女50例；年龄40～62岁，平均(50.03±7.45)岁。其中50例用于免疫组织化学测定，男6例，女44例；年龄40～60岁，平均(49.96±7.97)岁。10例用于免疫印迹检测。两组对象基本临床情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有标本组织的获得均签署书面协议，且研究经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 正常山羊血清(美国Vector laboratories公司，货号S-1000)；GLP-1R兔多克隆抗体(英国Santa Cruz公司，货号ab188605)；CK17兔单克隆抗体(英国Santa Cruz公司，货号ab109725)；生物素标记的山羊抗兔IgG(美国Vector laboratories，货号BA-1000)；亲和素-生物素-酶复合物(ABC)复合物(美国Vector laboratories，货号PK-4000)；二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(美国Vector laboratories，货号SK-4100)；兔抗β-Actin多克隆抗体(北京普利莱基因技术有限公司，货号C1845)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号A0208)。

1.2.2 免疫组织化学染色 (1)组织处理：将全部标本放入4%多聚甲醛中固定96 h，梯度蔗糖溶液逐级脱水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，行冰冻切片，每份标本2套组织切片，收入缓冲液中。(2)染色：切片分别行封闭液(30%H2O2和正常山羊血清和Triton-X-100)室温处理30 min，一抗兔抗GLP-1R(1∶3 000)和兔抗CK17(1∶1 000)4 ℃孵育24 h，二抗生物素标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)室温孵育2 h，ABC复合物室温孵育2 h，DAB显色，缓冲液漂洗，裱片，蔗糖逐级脱水，二甲苯透明及中性树胶封片，光学显微镜观察并拍照。(3)结果判定：参照文献[7]的方法，GLP-1R和CK17阳性反应为细胞质内呈现棕黄色颗粒，由2名经验丰富的病理医师采用双盲法阅片，在光学显微镜下任取5个视野。①按染色强度评分，0分为不着色，1分为浅棕黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；②按阳性细胞数评分，<5%为0分，5%～<26%为1分，26%～<51%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。综合①②判断结果：阴性0～1分；弱阳性2～4分；阳性5～8分；强阳性9～12分。

1.2.3 蛋白质印迹法检测 无菌条件下取甲状腺乳头状癌组织，裂解液处理后，BCA行蛋白定量，取蛋白上样行蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转膜、封闭，分别用一抗兔抗GLP-1R(1∶20 000)和兔抗CK17(1∶15 000)孵育过夜，二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000)处理，化学发光液处理，显影和定影；应用β-actin为内参，运用NIH Image图像分析软件分析GLP-1R和CK17蛋白的平均吸光度值(average absorbance，AA)，与内参照吸光度值比较后再行结果统计分析。

2 结 果

2.1 两组对象甲状腺组织中GLP-1R阳性表达比较 GLP-1R的阳性反应在正常甲状腺组织中基本缺失(图1A)，在甲状腺乳头状癌组织中呈散在分布，为粗细不等的棕黄色颗粒(图1B、C、D)。对照组中GLP1R蛋白低表达，阳性率为44.00%(22/50)；观察组中GLP1R蛋白表达阳性率为96.25%(77/80)，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 两组对象甲状腺组织中CK17表达水平比较 CK17在对照组呈阴性反应(图2A)，而在观察组其阳性反应在细胞质中表达(图2B、C、D)；对照组中CK17表达阳性率为16.00%(8/50)；观察组中CK17阳性表达率为96.25%(77/80)，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

A：对照组阴性表达；B：观察组弱阳性表达；C：观察组阳性表达；D：观察组强阳性表达。

图1 GLP-1R在两组对象甲状腺组织中的表达(×100)

A：对照组阴性表达；B：观察组弱阳性表达；C：观察组阳性表达；D：观察组强阳性表达。

图2 CK17在两组对象甲状腺组织中的表达(×100)

2.3 GLP-1R和CK17蛋白免疫印迹结果分析 免疫印迹结果表明，GLP-1R和CK17蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达明显增多(图3)，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

图3 两组对象甲状腺组织中GLP-1R 和CK17的表达

组别nGLP1RCK17对照组100.431±0.060.215±0.03观察组200.703±0.09a0.722±0.09a

a：P<0.01，与对照组比较。

2.4 GLP-1R和CK17阳性表达与甲状腺乳头状癌临床病理因素的关系 GLP-1R与甲状腺乳头状癌的临床病理因素间差异无统计学意义(P>0.05)；CK17与甲状腺乳头状癌患者的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，与肿瘤的直径、临床分期及颈部淋巴结转移相关(P<0.05)，见表2。

表2 GLP-1R 和CK17阳性表达与甲状腺乳头状癌临床病理因素的关系(n=80)

3 讨 论

甲状腺乳头状癌是发病率增长较快的恶性肿瘤之一，依据WHO肿瘤学分类标准：甲状腺乳头状癌属甲状腺恶性上皮肿瘤，具有明显的滤泡细胞分化、特征性胞核改变，乳头及滤泡结构可界定为典型[8]。然而，在临床病理诊断和研究中常有不典型病例存在，此外乳头状甲状腺癌的一些病理特征，如颈部淋巴结转移等在患者初始治疗时，采取术前超声、术中触诊等均未能确诊隐性颈部淋巴结的转移状态[9]。因此，本研究应用免疫组织化学和免疫印迹法对甲状腺乳头状癌进行辅助诊断。

GLP-1R是胰高血糖素受体亚家族，属G蛋白偶联受体B家族，可介导GLP1发挥生物学作用[10]。GLP-1R不仅表达于胰腺，也表达于胰腺外组织，包括中枢神经系统、心血管、胃肠道、肾脏等[11]。GLP-1R被激活后，G蛋白β和γ亚基经磷脂酰肌醇-3-激酶及丝裂原活化蛋白激酶信号途径对β细胞的增殖和分化起到诱导效果[12-13]。近年研究发现，GLP-1R在甲状腺乳头状癌细胞也呈大量分布，文献报道啮齿类动物使用艾塞那肽(GLP-1R激动剂)可诱发甲状腺C 细胞的增生及甲状腺癌的发生[14-15]。提示GLP-1R可能是甲状腺乳头状癌的一种新指标蛋白，但GLP-1R在人甲状腺乳头状癌组织中的表达及其与其病理因素的相关性尚鲜见报道。

本研究应用免疫组织化学法检测GLP-1R的阳性表达结果提示，GLP-1R在正常甲状腺组织中阳性反应基本缺失，在甲状腺乳头状癌组织中呈散在分布；50例正常甲状腺组织中22例(44.00%)有GLP-1R蛋白低表达；80例甲状腺乳头状癌组织中77例(96.25%)有GLP1R蛋白表达，二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。免疫印迹结果表明：GLP1R在甲状腺乳头状癌组织中的水平明显高于对照组(P<0.01)。进一步分析发现，GLP-1R与甲状腺乳头状癌的临床病理因素无明显相关。有研究发现，人甲状腺乳头状癌细胞中存在大量GLP-1R表达，但GLP-1R激动剂对甲状腺癌细胞的增殖无显著促进作用[16-17]。因此，本研究通过不同检测方法进一步证实了上述结果。

CK17是一种细胞骨架蛋白，在人位于染色体17q12-q21，转录长度为1 299 bp，相对分子质量为48.1×103，在正常组织CK17表达于复层上皮细胞，肿瘤组织中则位于腺癌及鳞状细胞癌[18-19]。文献报道称CK17在乳头状癌组织中呈局灶性表达，且分化好的乳头状癌未见阳性表达，而CK17的表达与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移呈正相关[20-21]。本研究采取免疫组织化学染色发现，CK17在正常喉组织呈阴性反应，在甲状腺乳头状癌组织CK17的阳性反应主要位于细胞质；50例正常甲状腺组织中有8例CK17表达阳性(占16.00%)，80例甲状腺乳头状癌组织中CK17阳性表达有77例(占96.25%)，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。免疫印迹检测发现：CK17蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达明显增多，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。进一步分析发现，CK17与甲状腺乳头状癌患者的性别、年龄间无显著性差异，与肿瘤的直径、临床分期及颈部淋巴结转移间有显著性相关。与上述文献报道一致，提示CK17与甲状腺乳头状癌的发生、发展存在密切相关，可能作为临床鉴别诊断该肿瘤的分子学标志物。

综上所述，GLP1R和CK17在甲状腺乳头状癌组织中均呈高表达，GLP1R的高表达与甲状腺乳头状癌的病理因素间无显著性相关，CK17的高表达与甲状腺乳头状癌的临床病理因素间呈正相关。由于本研究为小样本试验及免疫组化方法存在假阳性结果等情况，上述结果仍需大样本进一步验证。

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Expressions of GLP-1R and CK17 in papillary thyroid cancer and clinical significance

ZengXi1,ChenJia2,TianYi2

(1.DepartmentofNuclearMedicine,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China; 2.DepartmentofNuclearMedicine,AnshunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Anshun,Guizhou561000,China)

Objective To investigate the expressions of glucagon-like peptide-1 receptors(GLP-1R) and cytokeratin17 (CK17) in papillary thyroid cancer tissue and clinicopathological significance.Methods The immunohistochemistry and immunoblotting method were employed to detect the expressions of GLP-1R and CK17 in normal thyroid tissues (control group,50 cases) and papillary thyroid cancer tissue (observation group,80 cases).Then the correlation between the expressions of GLP-1R and CK17 with pathological factors of thyroid cancer was analyzed.Results Low expression of GLP-1R was found in 22 cases(44.00%) of the control group,while GLP-1R was expressed in 77 cases(96.25%) of the observation group,and the difference between both groups was statistically significant(P<0.01).The expression of CK17 was positive in 8 cases(16.00%) of the control group,while 77 cases(96.25%) in the observation group were CK17 expression positive,and the difference between both groups was statistically significant(P<0.01).The difference between GLP-1 positive expression and clinicopathologic factors had no statistical significance(P>0.05).The difference between CK17 expression with sex and age had no statistical significance (P>0.05),and was obviously related with the tumor diameter,clinical stages and cervical node metastasis of thyroid neoplasms(P<0.05).Conclusion GLP-1R and CK17 all are highly expressed in papillary thyroid cancer tissue and CK17 expression is obviously related with the tumor diameter,clinical stages and cervical node metastasis of papillary thyroid cancer.

thyroid neoplasms;glucagon-like peptide-1 receptors;cytokeratin 17;immunohistochemistry;immunoblotting

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.07.017

曾曦(1973-)，副教授，硕士研究生，主要从事甲状腺疾病的诊治研究。

R739.91

A

1671-8348(2017)07-0919-04

2016-09-03

2016-11-21)