结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与生物膜

赵继利，刘微，王铁鹏，袁俐

1. 石河子大学医学院病原微生物与免疫学教研室，石河子832000； 2. 石河子大学医学院生物化学教研室，石河子832000

结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统与生物膜

赵继利1，*，刘微1，*，王铁鹏2，袁俐1

1. 石河子大学医学院病原微生物与免疫学教研室，石河子832000； 2. 石河子大学医学院生物化学教研室，石河子832000

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起结核病的病原菌。其处于持续生存的休眠状态时，可导致长期无症状感染，称为结核潜伏感染。研究显示，结核分枝杆菌染色体中存在大量 “毒素-抗毒素系统”(toxin-antitoxin system，TAS)，某些TAS在潜伏感染中发挥作用，可调节细菌生长和诱导细菌进入休眠状态；某些TAS参与生物膜形成和应激反应，但其影响生物膜形成的机制尚未阐明。生物膜中的结核分枝杆菌对多种抗结核药物耐药，且能抵抗宿主免疫系统防御；休眠状态的结核分枝杆菌对抗结核药物通常也是耐受的，给结核病治疗带来了巨大挑战。本文就近年来结核分枝杆菌TAS与生物膜的研究及抗结核药物对生物膜形成的影响进行综述。

结核分枝杆菌；毒素-抗毒素系统；生物膜

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)可引起结核病，具有产生持续感染或潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的能力。潜伏感染状态中的结核分枝杆菌被认为处于休眠状态，这对其进入人体后在压力环境中的生存至关重要。休眠状态下，结核分枝杆菌的生理功能发生明显变化，生长减慢，对抗生素耐受，因为绝大多数抗生素作用于细菌繁殖的活动期[1]。潜伏感染状态可持续数年、数十年之久，并不引起临床症状。目前为止，结核分枝杆菌如何减慢或停止复制而转为休眠状态的分子转换机制尚不清楚，但此过程与大肠埃希菌“毒素-抗毒素”(toxin-antitoxin，TA)引起的“准休眠”显著一致[1-2]。结核分枝杆菌在感染过程中呈现显著的非繁殖持续感染状态或休眠状态以及生物膜形成，对其致病性至关重要。其染色体中存在大量TA，与潜伏感染、生物膜形成和对抗环境压力密切相关[2-5]。

1 TA复合物及其分类

绝大多数细菌和古生菌可编码产生TA，也称为毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system，TAS)。该系统由毒素及其同源抗毒素组成，毒素破坏产生它的细菌，抗毒素则阻止毒素的破坏作用[6]。TAS并不分泌到细菌外，仅存在于菌体内，一旦激活，将从菌体内部使细菌遭到破坏。典型的一对TA基因由单一操纵子控制，基因转录与翻译紧密耦合，以确保产量合适[6]。TA基因首次在质粒中被鉴定，后来发现染色体中也存在，也存在于其他移动遗传因子中，包括前噬菌体、转座子或超级整合子[6]。在细胞分裂期间，TAS参与保护和维持外源性DNA稳定。TA基因缺失的细菌，因其抗毒素无法合成，被释放至胞质内的外毒素所破坏、清除。微生物基因组综合分析揭示，TAS在原核微生物中相当丰富，而在某些胞内寄生虫中并不存在[7]。TAS通过降低细菌代谢，阻止细胞周期启始，甚至介导利他型程序性细胞死亡来帮助细菌应付外界各种压力[8-10]。不同的TAS可响应不同的环境压力，但某些TAS的功能有重叠。比较基因组分析表明，流行菌株比非流行菌株编码的TAS多得多。在宿主免疫系统力图清除入侵的病原体时，病原体的TAS被激活，从而起到防御作用[11-12]。也有报道不支持此结论，因为有的病原体缺乏TAS，而有的非致病性立克次体则存在TAS[13]。因此，TAS可能具有物种特异性，而不仅仅反映细菌的生活方式与致病性的相关性。TAS中的毒素一般是蛋白，相对分子质量较小(<10 000)，毒素中心由数个片层紧密折叠成球状；而抗毒素可为蛋白或起调节作用的小分子RNA[6]。不同TAS家族的毒素结构不同，作用方式也不相同。蛋白型抗毒素较少有共同结构，并缺乏合适的折叠，易被蛋白酶降解[6]。TAS的作用机制取决于病原菌在不同生活时期的生物学特性。毒素抵抗力强，比抗毒素寿命长，抗毒素易被细胞核酸酶或蛋白酶降解。受不同的环境或细胞内刺激后，毒素与抗毒素之间的平衡被打破，抵抗力强的毒素被激活，作用于胞内靶分子，引起抑菌或杀菌效应[6]。这些作用对细菌群体是有益的，面对外界压力，TAS呈现抑菌活性，或诱导部分细菌利他型“自杀”。

根据抗毒素抑制毒素活性的机制，TAS可分成6个型[6]：Ⅰ型，反义RNA抗毒素和毒素mRNA形成异源双链，阻止毒素翻译。Ⅱ型，毒素与抗毒素均为蛋白，两者结合在一起，形成稳定复合物，抗毒素遮盖了毒素的活性位点。Ⅲ型，抗毒素为小RNA，直接与毒素相互作用，阻碍毒素的活性。Ⅳ型，抗毒素直接与毒素的作用靶点相结合，保护该靶蛋白免受毒素作用。Ⅴ型，抗毒素作为毒素的特异性mRNA核酸酶，作用于毒素mRNA。Ⅵ型，为最近报道，抗毒素辅助ClpXP蛋白酶，执行水解接头蛋白的功能，介导ClpXP对其同源毒素的水解。此外，细菌限制性修饰系统及ppGpp-SpoT系统中此类代谢物(修饰产物)与酶的配对组合也具有某些TAS的特征，可认为它们属于类TAS。TASⅠ型和Ⅱ型广泛分布于原核细胞型微生物中，其他4型目前报道不多。不过，将生物信息分析技术与不断改进的微生物基因组高通量筛选方法(如鸟枪法克隆)相结合，有望发现更多的TAS家族成员[14]。

2 结核分枝杆菌TAS及其作用

结核分枝杆菌染色体中有大量TAS模块(>80)，大多属于VapBC、MazEF、RelBE、ParDE、Ccdab或HigBA家族，比其他任何病原体都多[2,15]。已鉴定出H37Rv有79个TAS，其中67个属Ⅱ型，包括50个VapBC系统、10个MazEF系统、2个RelBE系统、2个HigBA系统、2个ParDE系统和1个YefM-YoeB系统；1个属受类似分子伴侣SecB控制的Ⅱ型；3个属潜在的Ⅳ型；8个属假定不典型TAS。这些TAS中，37个显示有功能[16]。在结核分枝杆菌及其他人类病原菌中，TAS有助于细菌的致病性，包括增强细菌毒力，促进持续感染、细菌休眠、细菌生物膜形成、对抗生素抵抗及病原体传播等[17-18]。结核分枝杆菌在感染过程中可能遭遇多种压力如低氧[15,19]、DNA损伤[20]、营养缺乏[21-22]、被巨噬细胞吞噬[23-25]、热休克[26]和抗生素[27-29]等，TAS如parDE2等被激活，通过降低细菌代谢活性，形成冬眠的持续感染(潜伏感染)状态以适应宿主内的压力环境[30]。在上述应激条件下，抗毒素被蛋白酶降解或消耗，毒素释放后干扰或改变细菌DNA复制、ATP和细胞壁合成，介导细菌死亡或耐药性形成[31]。结核分枝杆菌的许多外毒素是序列特异性切割mRNA的内切核糖核酸酶，抑制其转录。VapC则通过特异性切割结核分枝杆菌tRNA抑制其翻译。大量证据也支持TAS在致病方面发挥作用。结核分枝杆菌编码2个功能性TAS分子RelBE和YefM-YoeB，其中RelE和YoeB是毒素，而RelB和YefM为抗毒素。氮源缺乏和氧化应激时，RelBE和YefM-YoeB 操纵子上调；低氧时，则下调。这些现象与结核分枝杆菌的传播及流行相关。低氧期间，VapBC和HigBA模块表达增加。与此相似，结核分枝杆菌暴露于某些抗生素时，编码RelE和 YoeB的基因表达明显增加，促进细菌进入持留生存状态，对抗生素不敏感[6]。结核分枝杆菌编码10个MazEF系统，MazF是序列特异性内切核糖核酸酶，切割mRNA、rRNA或tRNA，可被其同源抗毒素MazE中和。模拟感染阶段的压力情景，包括营养耗竭、低氧、暴露于抗生素和进入不可培养阶段等，MazF的表达上调，结核分枝杆菌形成持留状态[6]。删除3个MazF基因，可显著减少豚鼠体内结核分枝杆菌数量，同时减轻肝、脾的病理损伤，推测与删除基因的菌株传播力降低有关[15]。TAS的转录和表达在不同压力条件下呈现出不同变化，导致潜伏或持续感染、休眠、对抗生素不敏感、对压力出现反应[32-35]和生物膜形成[6,36]等。

3 结核分枝杆菌生物膜的结构及作用

除蛋白、脂质和DNA外，多糖是结核分枝杆菌生物膜重要组成部分，纤维素则是多糖中的关键成分[36]。Trivedi等[36]研究表明，结核分枝杆菌面对巯基还原剂压力时，无论振荡还是静置培养均能诱发生物膜形成。其生物膜由微小菌落与细胞外基质共同组成，细胞外基质包括蛋白、脂质、多糖和胞外DNA，作为细菌长期营养缺乏期间的营养来源。采用扫描电子显微镜研究结核分枝杆菌生物膜的结构，发现这些生物膜中含有大量毛孔和通道，借此促进营养成分分布于整个生物膜内的细菌中。生物膜内的细菌被紧紧包裹在细胞外基质中，类似多糖聚合物。Trivedi等采用转录组分析方法，证明胞内巯基还原剂压力诱导编码核糖体蛋白的基因显著下调，抑制所有蛋白合成，从而抑制细菌增殖和促进生物膜形成等代谢变化。在该研究发表以前，自由真菌酸被认为是结核分枝杆菌生物膜细胞外物质的主要成分。但该研究的脂质染色显示，脂质主要位于细菌的细胞局部，而不是细菌外间隙内，提示它们只是细胞外物质中较小的一部分，且生物膜形成期间编码脂质生物合成的大量基因显著下调。Trivedi等还发现，纤维素是结核分枝杆菌生物膜细胞外基质的主要成分。由于纤维素是各种细菌如沙门菌[37]和大肠埃希菌[38]生物膜的细胞外成分，而人类缺乏，或许它可作为生物标记，检测人体内结核分枝杆菌生物膜。在给予结核分枝杆菌巯基还原剂压力时，同时使用纤维素酶和蛋白酶，可抑制生物膜形成，表明纤维素和结构蛋白是结核分枝杆菌附着所需的基础。在另一个结核分枝杆菌生物膜形成模型中，DNA降解导致生物膜解体[39]，表明DNA参与生物膜的结构，在铜绿假单胞菌生物膜中也观察到此现象[40]。Trivedi等的研究还显示，生物膜内驻扎着耐药但新陈代谢活跃的结核分枝杆菌，与浮游细菌相比，生物膜内的细菌并未改变ATP/ADP、NAD+/NADH 和NADP+/NADPH水平，生物膜的形成需合成DNA、RNA和蛋白。转录分析表明，生物膜内结核分枝杆菌中只有7%的基因调节生存。

据估计，约80%的人类细菌性慢性炎症和感染性疾病涉及细菌生物膜[41]。生物膜引起膜内细菌多重耐药，逃避宿主免疫系统，其所致持续性感染难以治疗[42]。生物膜的形成受多个TAS的影响，目前最深刻的来自大肠埃希菌的研究[36]。该研究结果显示，与生物膜形成相关的TAS涉及MazFE、MqsRA、HipAB、Hha-TomB 和YafQ-DinJ。Ⅱ型TAS中的MqsRA与生物膜形成的调节网络中，抗毒素MqsA除与毒素MqsR结合抑制其毒性外，还直接抑制主管压力的RpoS表达，降低主要调节者CsgD的产生，而CsgD转录可激活菌毛基因及adrA基因表达，前者与细菌菌毛形成有关，后者导致合成c-di-GMP，产生纤维素。菌毛和纤维素均为生物膜的重要组成。此外，csgD基因在RNA聚合酶的作用下转录，该RNA聚合酶包含稳定相σ亚基(RpoS)，可抑制FlhD的表达，而FlhD的编码产物调节鞭毛生物合成。因此，缺乏压力时，RpoS和CsgD 受到抑制，不利于细菌生物膜形成。在压力条件下，抗毒素MqsA被Lon蛋白酶降解，导致RpoS和CsgD脱抑制。激活的RpoS使内部信使c-di-GMP浓度增高，纤维素生成，CsgD转录促使菌毛产生，FlhD受到抑制，鞭毛合成受限，这种调节网络导致运动性降低，增加生物膜形成。HipBA可通过裂解细胞释放DNA，致细胞外黏附加强，继而影响生物膜形成。除TA基因外，还有某些基因与结核分枝杆菌生物膜形成相关。刘霞[43]等采用转座子突变技术并结合生物信息学分析发现，在结核分枝杆菌中分离并鉴定与其生物膜形成相关的基因有MRA_3775(Rv3737)，其编码保守的跨膜蛋白，缺失可导致H37Ra完全丧失形成生物膜的能力。成膜能力只有30%左右的生物膜缺陷株H37Ra所涉及的基因分别有MRA_0106(Rv0101)、MRA_1814(Rv1801)和MRA_1873(Rv1682)。其中MRA_0106(Rv0101)参与脂质代谢过程；MRA_1814是PE/PPE相关基因，表达产物为PPE家族的PPE29，系结核分枝杆菌特有，其结构特异，在结核分枝杆菌生存、增殖和致病方面起重要作用。王星等[44]研究显示，编码丙酮酸脱氢酶复合物辅酶E1的aceE是新发现的影响分枝杆菌生物膜形成的重要基因；mmaA4基因也是结核分枝杆菌的一个基因簇，编码4个密切相关的甲基转移酶，向分枝菌酸引入环丙烷和甲基分支，参与分枝菌酸合成，涉及结核分枝杆菌生物膜形成及毒力。Ojha等[45]报道，Rv1013基因编码酰基辅酶A合成酶，影响生物膜成熟过程；Rv2454c-Rv2455c基因共同编码2-酮戊二酸脱氢酶，有助于生物膜形成。Pang等[46]发现，Rv2946c基因也有助于结核分枝杆菌生物膜形成。

4 抗结核药物对生物膜形成的影响

结核分枝杆菌可引起严重的长期肺部感染，治疗不当会造成较高的死亡率。除逃避宿主免疫防御外，结核分枝杆菌部分亚群进入休眠状态也是其诱导持久感染的主要原因之一。休眠菌或潜伏结核分枝杆菌的间歇性复苏可引起结核病反复和复发[6]。细菌形成的生物膜，作为物理屏障可影响药物进入细菌，并抵抗宿主免疫系统的防御，是许多慢性炎症和感染性疾病(如结核病)难以治愈的重要原因。Dalton等[47]应用结核分枝杆菌BSG001，体外研究如何有效治疗结核分枝杆菌生物膜的形成。结果发现，4种主要一线抗结核药物及某些新的抗结核药物可抑制生物膜形成，但治疗生物膜内细菌比治疗浮游菌的抗生素浓度高20～1 000倍以上，这是临床治疗中值得考虑的潜在重大问题。刘京铭等[48]进行体外实验，研究结核分枝杆菌生物膜形成与结核病复治的关系，发现复治菌株较初治菌株有更强的成膜性。异烟肼和利福平对生物膜有抑制作用，对相应耐药菌株的生物膜形成也有抑制作用。赵志辉等[49]研究利福平对结核分枝杆菌在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影响，结果显示利福平干预后，植入材料界面黏附的菌落显著减少，聚乙烯界面生物膜呈不同程度的破坏，认为利福平能抑制结核分枝杆菌对不同植入材料界面的黏附及生物膜形成。

5 结语

TAS是压力反应元件，参与抑制细菌生理，使结核分枝杆菌进入低代谢、休眠状态，并对抗生素耐受。最近研究提示，结核分枝杆菌中许多TAS参与其生物膜形成[6,36]，虽然机制还不清楚，但进一步探究其调节生物膜形成的机制，有可能使其成为预防和治疗结核病的新靶标。

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. YUAN Li, E-mail: yuanli832002@163.com

Toxin-antitoxinsystemsandbiofilmofMycobacteriumtuberculosis

ZHAO Jili1,*, LIU Wei1,*, WANG Tiepeng2, YUAN Li1

1.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,MedicalSchoolofShiheziUniversity,Shihezi832000,China; 2.DepartmentofBiochemistry,MedicalSchoolofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Mycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) is causative pathogen of tuberculosis, and could induce long-term asymptomatic infection, known as latent tuberculosis infection (LTBI), in which the bacteria are thought to persist in a dormant state. It is reported that there are pairs of toxin-antitoxin systems (TASs) in chromosomes ofM.tuberculosis. Some TASs play roles in the latent infection because they could not only regulate the bacterial growth, but also induce the bacteria to enter dormant state. Some TASs are suggested to be involved in the biofilm formation and stress reaction, but how they regulate biofilm formation has not yet been elucidated.M.tuberculosisin biofilm is resistant to many drugs and host immune protections.M.tuberculosisin dormant state is usually multidrug-resistant. These issues bring challenges for the treatment of tuberculosis. This review focuses on the research progress on TAS and biofilm formation ofM.tuberculosis, as well as the effect of anti-tuberculosis drugs on biofilm formation.

Mycobacteriumtuberculosis; Toxin-antitoxin system; Biofilm

国家自然科学基金(81560264)

袁俐

*同为第一作者

2016-12-07)