MTT法检测异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用

夏春辉，王玉，陈宇航，孙东升，付双，李红梅

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔161006

MTT法检测异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用

夏春辉，王玉，陈宇航，孙东升，付双，李红梅

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江齐齐哈尔161006

目的研究异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT法)测定异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用。结果异咯嗪光动力能明显抑制Bel-7402细胞。结论异咯嗪是一种很有潜力抗癌光敏剂。

异咯嗪；光动力；凋亡；Bel-7402细胞

肿瘤光动力治疗(photodynamic therapy)是一种新型的治疗肿瘤技术。该技术是基于特定波长的光激发肿瘤细胞摄入的光敏剂，生成活性很强的活性氧，从而杀死肿瘤细胞[1-3]。光敏剂是光动力治疗的关键。由于异咯嗪毒副作用小，表现出较强的光敏特性，因而它可能是很有前途的抗肿瘤光敏剂[4-6]。该文采用四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT染色法)研究了异咯嗪（结构见图1）光动力对Bel-7402细胞的抑制作用，以期为其临床应用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 材料

异咯嗪与MTT为Sigma公司产品；DMEM培养基Gibco公司产品；牛血清为PAA公司产品；其他试剂为国产分析纯；Bel-7402人肝癌细胞为哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供。

1.2 仪器及设备

VS-1300L-U净化工作台；3111二氧化碳培养箱；SB-100P黑光灯；DSZ－5000X倒置生物显微镜，680全自动酶标仪。

1.3 细胞培养

在37℃，含5%CO2的培养箱内，Bel-7402人肝癌细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基（链霉素与青霉素的终浓度为100 mg/L）培养。

1.4 MTT染色法测定异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用

取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后，调整浓度约为4×104个/mL，然后接种于96孔培养板中。在培养孔中加入浓度为4 μg/mL的异咯嗪新培养液，用SB-100P灯照射60 min。在37℃下加入PBS配制的MTT溶液（5 g/L），培养4 h，在倒置显微镜下观察经异咯嗪光动力作用后的细胞。吸取上清，加入200 μL DMSO，在波长570 nm处测定吸光度值A。然后根据公式：细胞抑制率=(1－A实验孔/A空白对照孔)×100%进行计算。

图1 异咯嗪光敏剂的结构

2 结果

MTT法研究了异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制率影响。图2显示异咯嗪光动力能明显抑制Bel-7402细胞，在光照60 min后，异咯嗪表现出对Bel-7402细胞极强的杀伤能力，其抑制率达到70%左右。此外，MTT染色显示：未经异咯嗪光动力处理的Bel-7402细胞MTT染色后，在细胞内及细胞周围生成分布比较均匀的紫蓝色Formazan结晶（图3A）；而Bel-7402细胞经过经异咯嗪光动力作用后，细胞数目明显降低，细胞结构遭到破坏，细胞失去了还原MTT能力，导致紫蓝色结晶明显减少，细胞处于调亡和坏死状态（图3B）。

图2 MTT法分析异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制率

图3 MTT染色分析异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用

3 讨论

一些研究显示异咯嗪光动力对肿瘤细胞的抑制作用[7-8]，然而异咯嗪光动力对Bel-7402细胞的抑制作用还鲜见报道。因此，在该研究通过MTT染色法研究了异咯嗪光动力对Bel-7402细胞作用。结果显示，异咯嗪光动力能明显抑制Bel-7402细胞增殖。作用机理可能是：肿瘤细胞摄入的异咯嗪（A）在特定波长激发后，通过系间窜跃，基态的A变为激发三线态（3A*）；3A*与H2O和O2反应，或与三线态氧（3O2）反应，产生过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）、超氧负离子自由基（·O-2）、单线态氧（1O2）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）；ROS与细胞膜内外的生物大分子(如蛋白质、酶类和脂类等)发生氧化反应，从而导致Bel-7402细胞凋亡或坏死。该过程可用如下反应式表示：

[1]Lu K,He C,Lin W.Nanoscale metal-organic framework for highly effective photodynamic therapy of resistant head and neck cancer[J].J Am Chem Soc,2014,136(48):16712-16715.

[2]Li X,Zhou ZP,Hu L,et al.Apoptotic cell death induced by 5-aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy of hypertrophic scar-derived fibroblasts[J].J Dermatolog Treat, 2014,25(5):428-433.

[3]Akens MK,Wise-Milestone L,Won E,et al.In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy on metastatic breast cancer cells pre-treated with zoledronic acid[J].Photodiagnosis and photodynamic therapy,2014,11(3):426-433.

[4]Park K.J.,Lee C.H.,Kim A,et al.S.Death Receptors 4 and 5 Activate Nox1 NADPH Oxidase through Riboflavin Kinase to Induce Reactive Oxygen Species-mediated Apoptotic Cell Death[J].The Journal of Biological Chemistry,2012,287(5): 3313-3325,.

[5]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Comparison of UVA-and UVA/riboflavin-induced growth inhibition of A-canthamoeba castellanii[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2013,251(2):509-514.

[6]Makdoumi K,B ckman A,Mortensen J,et al.Evaluation of antibacterial efficacy of photo-activated riboflavin using ultraviolet light(UVA)[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2010,248(2):207-212.

[7]Machado D,Shishido S.M,Queiroz K.C,et al.Irradiated riboflavin diminishes the aggressiveness of melanoma in vitro and in vivo[J].PLoS One,2013,8(1):E54269.

[8]De Souza Queiroz K.C.,Zambuzzi W.F.,Santos de Souza A. C,et al.A possible anti-proliferative and anti-metastaic effect of irradiated riboflavin in solid tumors[J].Cancer Letters, 2007，258(1):126-134.

Inhibition Effect of MTT Method in Detecting the Isoalloxazine Photodynamic on the Bel-7402 Cells

XIA Chun-hui,WANG Yu,CHEN Yu-hang,SUN Dong-sheng,FU Shuang,LI Hong-mei
Pharmacy College,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang Province,161006 China

ObjectiveTo research the inhibition effect of MTT method in detecting the isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells.MethodsThe inhibition effect of isoalloxazine photodynamic on the Bel-7402 cells was measured by the MTT method.ResultsThe isoalloxazine photodynamic can obviously inhibit the Bel-7402 cells.ConclusionIsoalloxazine is a potential photosensitizer.

Isoalloxazine;Photodynamic;Apoptosis;Bel-7402 cells

R735.7

A

1672-5654（2017）01（c）-0047-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.03.047

2016-10-23）

齐齐哈尔市科学技术计划项目（SFGG-201206）。

夏春辉（1969.12-），男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，教授，研究方向：功能材料制备与抗肿瘤机制研究。