王 益 万远太 刘 蓓 吴瑞乔 张 晶 严燕国
趋化因子受体CcR5在结肠癌中的表达及临床意义
王 益 万远太 刘 蓓 吴瑞乔 张 晶 严燕国
目的 探究趋化因子受体CcR5在结肠癌中的表达及临床意义。方法 收集经结肠癌根治术切除且经病理学检查证实为结肠癌组织标本94例,选取50例距离肿瘤边缘>5 cm,且经病理学检查为正常的癌旁组织作为对照,采用实时定量PCR和免疫组化的方法,分别检测结肠癌组织和正常癌旁组织中CcR5的 mRNA表达水平及阳性表达率,分析其与结肠癌临床病理学特征的关系。结果 结肠癌组织中CcR5 mRNA水平和阳性表达率明显高于正常癌旁组织的,差异具有统计学意义(P<0.05)。CcR5 mRNA 表达水平和阳性表达率与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期均有关,肿瘤大小>5 cm、出现淋巴结转移和肝转移、Ⅲ~Ⅳ期结肠癌患者CcR5的mRNA 表达水平和阳性表达率均相应高于肿瘤大小≤5 cm、未发生转移、Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。LMVD与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期和分化程度有关。相关性分析结果显示,CcR5的mRNA 表达水平与LMVD呈明显正相关(γ=0.9176,P=0.0099)。结论
趋化因子受体CcR5;结肠癌;转移;临床意义
(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:214~217)
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处,近几年的发病趋势明显上升,患者常因出现远处转移而死亡[1]。本文就趋化因子受体CcR5和微淋巴管密度在结肠癌中的表达情况进行研究,分别分析其与结肠癌临床病理学特征的关系,同时分析CcR5的表达水平与微淋巴管密度的相关性。
1.1 一般资料
在2012年5月至2015年12月期间,收集我院普外科经结肠癌根治术切除且经病理学检查证实为结肠癌组织标本94例,组织标本保存于我院中心实验室-80冰箱。其中男性37例,女性57例,平均年龄为(63.2±12.1)岁,肿瘤大小>5 cm 60例,肿瘤大小≤5 cm 34例;TNM分期Ⅰ~Ⅱ期56例,Ⅲ~Ⅳ期38例,其中46例结肠癌伴淋巴结转移,20例结肠癌伴肝转移。术后病理组织学类型包括:管状乳头状腺癌49例,黏液腺癌、未分化癌45例;高分化结肠癌35例,中低分化结肠癌59例。入选标准:①接受结肠癌根治术且经病理组织学检查诊断为结肠癌;②手术前未接受放化疗和生物治疗;③TNM分期为Ⅰ~Ⅳ期。选取50例距离肿瘤边缘>5 cm,且经病理学检查为正常的癌旁组织作为对照。
1.2 研究方法
1.2.1 实时定量PCR检测CcR5 mRNA的表达水平
采用实时定量PCR检测CcR5 mRNA的表达水平。具体过程如下:采用QIAquick RNA Extraction Kit(购自QIAGEN公司,德国)抽提结肠癌及癌旁组织的总RNA。浓度及纯度符合要求的RNA进行合成cDNA第一链,cDNA第一链的合成按照First Strand cDNAsynthesis Kit操作说明(Takara公司,日本),反应条件为:42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一链放于-20 ℃冰箱保存备用。根据CcR5基因序列,在Oligo7.5软件上设计CcR5荧光定量引物,引物序列为:CcR5-F:5’-CCCTTGACCAGAGTCGAGTTG-3’,CcR5-R:5’-CAAGACTGTGGTCAGGAC-3’,扩增片段长度为115 bp,以GAPDH作为参考基因,引物序列为:5’-CGACGTAGTCTCATCT GACTT-3’,5’-GTT GCAGTCGACATAATCGTTGA-3’,片段长度为112bp,引物均由上海生工有限公司合成。实时荧光定量PCR20 μl反应体系为:cDNA第一链1 μl,2x Trans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl,引物1(10uM)0.6 μl,引物2(10uM)0.6μl,Passive Reference Dye 0.4 μl,ddH2O 7.4 μl(试剂购于北京全式金有限公司),反应在ABI7500荧光定量PCR仪中进行,扩增程序为:95 ℃预变性3 min,95 ℃10 s;58 ℃20 s;72 ℃30 s,35个循环,同时进行溶解曲线的分析,程序为:60 ℃1 min;95 ℃30 s。应用ABI7500分析软件分析CcR5及GAPDH基因的Ct值,采用2-Ct法计算正常癌旁组织及结肠癌组织中CcR5的相对表达量,采用公式Ct=Ct(CcR5基因)-Ct(GAPDH基因)。
1.2.2 免疫组化染色检测CcR5在结肠癌组织中的表达 CcR5抗体按1∶200稀释,采用SP法对结肠癌组织标本及癌旁组织标本进行免疫组织化学染色,PBS代替一抗作为阴性对照,已知阳性组织切片作为阳性对照,以出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性判断标准,显微镜下选取5个视野进行观察。
1.2.3 微淋巴管密度(LMVD)计数 参照Weidner的标准进行LMVD计数:依据D2-40染色以阳性染色的单个内皮细胞分别计为一个阳性微淋巴血管,在低倍镜(×40)下选取阳性染色微淋巴管最丰富区域,然后在高倍镜下(×200)观察选定区域的5个视野,计算淋巴管数,计算2个最丰富区域、10个视野的平均淋巴管数目。
1.3 统计学处理
应用SPSS 18.0统计软件上进行统计分析,计量资料进行t检验,计数资料进行卡方检验,相关性分析采用Pearson分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CcR5的mRNA表达水平和LMVD与临床病理特征的关系
CcR5的mRNA表达水平与结肠癌患者年龄、性别、组织学类型、分化程度均无相关性(P>0.05);但与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期有关,其中肿瘤大小>5 cm的结肠癌患者CcR5的mRNA 表达水平明显高于肿瘤大小≤5 cm的结肠癌患者,差异具有统计意义(P=0.003);同时,出现淋巴结转移和肝转移患者CcR5 mRNA表达水平明显高于无转移患者(P<0.05);随着TNM分期的增加,结肠癌患者CcR5 mRNA表达水平也增高,Ⅰ~Ⅱ期患者CcR5 mRNA 表达水平明显低于Ⅲ~Ⅳ期患者(P<0.05),见表1。
LMVD与结肠癌患者年龄、性别、组织学类型无相关性(P>0.05),但与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期和分化程度有关,见表1。相关性分析结果显示,CcR5的mRNA 表达水平与LMVD呈明显正相关(γ=0.9176,P=0.0099)。
2.2 免疫组化检测结果
结肠癌组织中CcR5阳性表达65例,而正常癌旁组织中CcR5阳性表达12例,两组比较差异具有统计学意义(χ2=23.742,P<0.0001),见表2。CcR5阳性表达与结肠癌患者年龄、性别、组织学类型、分化程度均无相关性(P>0.05);但与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期有关,见表3。
表1 CcR5的mRNA 表达水平与结肠癌临床病理特征的关系±s)
表2 CcR5在结肠癌组织及癌旁组织中阳性表达/例
肿瘤的发生与发展与许多因素有关,有研究指出[2],趋化因子及其受体可控制免疫细胞趋化、刺激新血管形成、刺激释放炎症细胞因子,还可通过自分泌或旁分泌方式诱导癌细胞的增殖和辅助间质细胞进行侵袭和转移。趋化因子受体 CcR5具有7个跨膜结构域,作为G蛋白偶联因子超家族成员的中的1种细胞膜蛋白,CcR5是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一,也是细胞内β趋化因子的受体,具有调控T细胞和单核细胞/巨嗜细胞系的迁移、增殖与免疫的功能,主要在记忆性的静止期T淋巴细胞、单核细胞、未成熟的树突状细胞等细胞膜上表达。CcR5的表达水平与肿瘤的淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期及复发均有关,据报道[3],在非小细胞肺癌组织中,CcR5在肿瘤组织外周和转移淋巴结中高内皮微静脉的内皮细胞中呈高表达,而在未发生转移的淋巴结中,CcR5则在淋巴结滤呈高表达。结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,易通过淋巴结向肝、肺等远处发生转移,有研究指出[4],CcR7、CXCR4、CcR1等多种趋化因子均被认为与结肠癌与淋巴结转移及肝转移相关具有相关性。然而关于CcR5在结肠癌中的表达及临床意义的研究报道甚少。肿瘤浸润程度、淋巴结转移情况是评价恶性肿瘤预后的重要指标[5],LMVD与癌症的发生发展及侵袭转移密切相关。鉴于此,本文就CcR5和LMVD在结肠癌中的作用进行探究。
表3 CcR5的mRNA 表达水平与结肠癌临床病理 特征的关系/例
本文采用实时荧光定量PCR对结肠癌中组织和正常癌旁组织CcR5的mRNA表达水平进行检测,结果显示,结肠癌组织CcR5 mRNA水平明显高于正常癌旁组织的CcR5 mRNA水平,且差异具有统计学意义(P<0.05),提示CcR5高表达水平与结肠癌的发生有密切的关系。进一步对CcR5的mRNA表达水平与临床病理特征的关系进行分析,结果显示,CcR5的mRNA 表达水平与肿瘤大小和TNM分期均有关,肿瘤大小>5 cm和Ⅲ~Ⅳ期结肠癌患者CcR5的mRNA 表达水平均相应高于肿瘤大小≤5 cm、Ⅰ~Ⅱ期结肠癌患者(P<0.05)。目前,有研究指出[6],CcR5可能参与了结肠癌细胞的转移过程,通过淋巴结选择性高表达配体与高表达CcR5的结肠癌细胞的结合,进一步辅助肿瘤细胞通过淋巴系统向远处发生转移,本研究中,发生淋巴结转移患者的CcR5的mRNA 表达水平高于未发生淋巴结转移患者的水平,进一步说明了CcR5在结肠癌细胞转移过程中的作用,同时出现肝转移患者CcR5的mRNA 表达水平明显高于未出现肝转移患者,且出现肝转移患者CcR5的mRNA 表达水平明显高于出现淋巴结转移的患者,提示高表达的CcR5水平会促进结肠癌细胞发生远处转移。同时采用免疫组化的方法检测CcR5在结肠癌组织和正常癌旁组织中表达,结果显示CcR5在结肠癌组织阳性表达明显高于正常癌旁组织中的表达,差异具有统计学意义(χ2=23.742,P<0.0001),与CcR5的mRNA 表达水平分析结果一致。对LMVD的分析结果显示,LMVD与肿瘤大小、淋巴结转移、肝转移、TNM分期和分化程度均有关,与研究报道相符[7]。相关性的分析结果显示,CcR5的mRNA 表达水平与LMVD呈明显正相关(γ=0.9176,P=0.0099),进一步说明CcR5在结肠癌细胞转移过程中的作用。
综上所述,趋化因子受体CcR5在结肠癌组织中呈高表达,其高表达与结肠癌发生、发展、转移均有关,检测CcR5的水平对于结肠癌的诊断、预测结肠癌转移情况具有指导意义。
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(编辑:吴小红)
Expression of Chemokine Receptor CcR5 in Colorectal Cancer and Its Clinical Significance
WANGYi,WANYuantai,LIUBei,etal.
TianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430064
Objective To explore the expression of chemokine receptor CcR5 in colorectal cancer and clinical significance.Methods 94 cases of colorectal cancer specimens treated with colorectal cancer resection surgery confirmed by pathology examination were selected.Meanwhile,50 specimens of cancer adjacent normal tissues from the edge of the tumor>5 cm were the control group.The mRNA level of CcR5 and positive case of CcR5 in colorectal cancer tissues and normal adjacent tissues were detected using real-time quantitative PCR and immunohistochemistry method.The relationship of CcR5 mRNA level and positive case of CcR5 with clinicopathological features in colorectal cancer were analyzed.Results The mRNA level of CcR5 and positive case of CcR5 in colorectal cancer tissues were significantly higher than that in normal adjacent tissues,there showed statistically significant difference(P<0.05).mRNA expression level of CcR5 and positive case of CcR5 were both related with tumor size,lymph node metastasis,liver metastasis,TNM stage,which showed that CcR5 mRNA level and positive case of CcR5 in patients with tumor size>5 cm,lymph node metastasis and liver metastasis,Ⅲ~Ⅳ period were markedly higher than that in patients with tumor size ≤5 cm,no transfer,Ⅰ~Ⅱ period(P<0.05).LMVD related to tumor size,lymph node metastasis,liver metastasis,TNM stage and differentiation degree.Correlation analysis showed that the expression level of mRNA was positively correlated with LMVD(γ=0.9176,P=0.0099).Conclusion The high expression of chemokine receptors CcR5 is related to the occurrence and metastasis of colorectal cancer.Detection of CcR5 has instructive value for diagnosis and metastasis prediction of colorectal cancer.
Chemokine receptor CcR5;Colorectal cancer;Metastasis;Clinical significance
430064 武汉科技大学附属天佑医院
10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.012
R735.3+5
A
1001-5930(2017)02-0214-04
2016-04-21
2016-11-15)
趋化因子受体CcR5的高表达与结肠癌发生、转移均有关,检测CcR5对于结肠癌的诊断和预测转移情况具有指导意义。