衣原体质粒蛋白Pgp3的研究进展

谈园，吴移谋

南华大学医学院病原生物学研究所，衡阳 421001

·综述·

衣原体质粒蛋白Pgp3的研究进展

谈园，吴移谋

南华大学医学院病原生物学研究所，衡阳 421001

衣原体中普遍含有一个7.5 kb左右的隐蔽性质粒，在衣原体物种中高度保守。Pgp3为该质粒编码的相对分子质量约28 000的免疫原性蛋白，能分泌到宿主细胞胞质中。在衣原体感染期间人类抗体可识别Pgp3的天然三聚体结构。Pgp3在衣原体致病机制中起重要作用，是诱导输卵管积液的主要毒力因子，能中和抗菌肽LL37的抗衣原体活性，且其DNA疫苗对衣原体感染具有一定的保护作用。本文就Pgp3的结构、在衣原体致病中的作用及其在疫苗与诊断抗原方面的应用进行简要概述，为进一步研究衣原体感染的发病机制及其诊断与预防提供新的思路。

衣原体；Pgp3；质粒蛋白；致病机制

衣原体是一类专性细胞内寄生、具有独特发育周期的原核细胞型微生物，能引起人类疾病的有肺炎衣原体(Chlamydiapneumonia，Cpn)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci，Cps)和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)。Cpn主要引起呼吸道和肺部感染，通过呼吸道分泌物在人与人之间传播，可引起Cpn社区获得性肺炎等。Cps能在家禽中引起鸟疫，一般通过密切接触感染的鸟类而传播，也可感染人类引起呼吸道感染。Ct主要感染眼和泌尿生殖道，可引起沙眼、输卵管性不孕症和性传播疾病[1]。

大部分衣原体中含有一个隐蔽性质粒，基因序列高度保守，广泛存在于Ct、Cps和鼠衣原体(Chlamydiamuridarum，Cm)各血清型中，其中以Ct和Cm质粒的研究较为广泛。Ct和Cps质粒均编码8个开放读码框(open reading frame，ORF)ORF1～ORF8，即特定的Pgp1～Pgp8；Cm质粒编码7个ORF。各质粒编码蛋白的功能不同，Pgp7为质粒维护及体外表型变异的非关键蛋白，Pgp1、Pgp2、Pgp6、Pgp8为质粒维护和复制所必需，Pgp4、Pgp5可能参与调控染色体基因的表达[2-3]；而Pgp3是唯一能分泌到宿主细胞胞质中的质粒蛋白[4]，在衣原体致病机制中起重要作用，一直以来都是衣原体质粒的研究热点。本文就Pgp3的研究进展进行简要介绍。

1 Pgp3的结构及特征

Ct的Pgp3由ORF5编码，又称为pORF5，由264个氨基酸组成。Pgp3的天然结构为相对分子质量约84 000的三聚体，衣原体感染期间人类抗体可识别其三聚体的四级结构[5]。该蛋白通过二硫键整合到衣原体外膜蛋白复合物与外膜联系，并分泌到包涵体腔内和宿主细胞胞质中。

Galaleldeen等利用单晶X线衍射技术确定了Ct Pgp3的结构，发现其球状的C端结构域(C-terminal domain，CTD)及N端结构域(N-terminal domain，NTD)由三重卷曲螺旋连接而成。该三重卷曲螺旋呈中心平行，由特殊的极性与非极性残基成对交替而成，形成一种罕见的右手超螺旋结构[6]。Pgp3是第1个被报道具有一个完全封闭的三叶β螺旋结构蛋白。该结构同样出现在原核生物Ⅱ型DNA拓扑异构酶中。Pgp3 β螺旋结构中的一个亚结构类似于T4噬菌体β螺旋结构的次要纤维蛋白折叠区域，该区域为体内外次要纤维蛋白的三聚反应和折叠所必需[7]。此外，该结构的NTD与腺病毒纤维和补体结构也有相似性。C1q为构成补体C1的重要成分，其补充成分与Pgp3 CTD结构高度相似，通过免疫复合物的识别与激发经典补体途径在天然免疫中起重要作用；C1q能直接触发细胞防御反应，如趋化作用、细胞因子释放、吞噬作用及细胞毒作用[8]。

Pgp3的CTD具有与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员相似的折叠结构，最靠近CTD的同源染色体包括来自伯克菌的凝集素、C1q补充成分及部分炭疽杆菌芽胞外壁胶原样蛋白BclA，均具有生物黏附作用[6]。而NTD由建立在三聚体病毒蛋白样的典型结构性图案串联起来。CTD的TNF样区域与BclA蛋白结构相似，BclA的NTD能促使TNF样结构域远端定位于外膜，具有黏附作用和免疫原性；Pgp3、Bc2L-C和BclA的CTD为与哺乳动物TNF超家族成员最相似的细菌同源染色体。此外，噬菌体(PRD1)刺突蛋白也具有类似的TNF样区域，该刺突蛋白在宿主细胞的黏附中有重要作用，由此推测Pgp3 的CTD区域可能在宿主细胞识别及触发细胞防御反应中起作用。综上所述，Pgp3的特殊结构提示其可能在衣原体感染、对宿主细胞黏附及特定免疫应答方面起重要作用。

2 Pgp3在衣原体致病中的作用

2.1 诱导特定炎症反应

Mosolygó等体外研究发现Pgp3可通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，诱导THP-1细胞产生白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-8、TNF-α等多种前炎症细胞因子，并证实Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)参与该诱导机制[9]。p38/MAPK通路是MAPK通路中产生炎症因子的重要信号通道。邓红玉等在不同时间用pORF5融合蛋白免疫小鼠，同一时间处死并分离生殖道组织，发现免疫组小鼠输卵管组织中出现不同程度的肿胀和粘连，且小鼠阴道分泌物、脾细胞上清液及血清中TNF-α、IL-1β水平均显著高于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)对照组[10]。表明Pgp3能损伤小鼠生殖道组织，引起TNF-α、IL-1β等特定炎症因子水平升高。

Cao等用Pgp3质粒蛋白处理THP-1细胞，发现Pgp3能刺激NALP3(NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3)炎性复合体mRNA表达，进一步促进p38磷酸化，同时能促进IL-1β和IL-18呈时间和剂量依赖性的表达[11]。NALP3炎性复合体由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(cysteine-containing aspartate-specific protease 1，caspase-1)、NALP3和ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)组成，可通过caspase-1剪切从而为IL-1β和IL-18活化提供分子平台[12]。进一步用NALP3-siRNA、ASC-siRNA转染THP-1细胞或用caspase-1特异性抑制剂预处理THP-1细胞，再用Pgp3刺激THP-1细胞，发现IL-1β、IL-18表达均降低，表明Pgp3通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18；p38磷酸化水平与对照组相比无明显差异，表明激活NALP3对p38/MAPK信号通路没有影响；而用p38抑制剂预处理细胞，再用Pgp3刺激细胞，IL-1β、IL-18的表达水平均明显下降，提示Pgp3激活的p38/MAPK信号通路能影响NALP3的激活。以上结果表明，Ct Pgp3能诱导IL-1β、IL-18等前炎症因子形成，可能与激活p38/MAPK信号通路有关，且通过NALP3炎性复合体酶解形成有活性的IL-1β、IL-18。

2.2 诱导输卵管积液的主要毒力因子

Liu等分别构建缺失质粒基因Pgp3、Pgp4或Pgp7的Cm转化缺失株，通过不同部位感染小鼠以诱导输卵管积液[13]。结果显示，用Pgp3或Pgp4缺失的Cm转化株感染小鼠均不能导致输卵管积液，而Pgp7缺失的Cm转化株能诱导输卵管积液。此外，与Ct相似，Cm的Pgp4也是上调因子，Pgp4缺失可明显降低Pgp3表达，而Pgp3缺失不能显著影响Pgp4表达[14]。同样，Liu等未在缺失Pgp4的Cm转化株培养基中检测到Pgp3蛋白。Pgp3缺失还导致下生殖道(lower genital tract，LGT)Cm数量减少，在阴道或法氏囊内接种后，上生殖道(upper genital tract，UGT)获得的Cm数量也有所降低。以上结果表明，Pgp3不但能诱导小鼠输卵管积液，是小鼠输卵管积液中的毒力效应因子，而且是Cm在生殖道生存和繁殖的必要因素[13]。此外，因为Pgp3的天然结构为稳定的三聚体，其CTD类似于TNF-α受体结合域[5]，表明其可能通过激活TNF受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)信号通路，促进Cm诱导输卵管积液。

2.3 中和抗菌肽 LL37的抗衣原体活性

衣原体传染性子代原体(elementary body, EB)分泌到宿主细胞胞质外感染其他细胞，不可避免会接触富含各种抗菌物质的细胞外环境，如抗菌肽。其中LL37为抗菌肽家族中唯一存在于人体的抗菌肽，是中性粒细胞特殊颗粒的主要蛋白，广泛存在于中性粒细胞、单核细胞、子宫颈及阴道鳞状上皮细胞中，具有一定的趋化作用和抗内毒素作用。Hou等研究发现，与单独用抗菌肽LL37处理组相比，Pgp3与LL37共同处理组细胞TNF-α表达水平显著升高。此外，用Pgp3与衣原体共同处理细胞后，LL37的表达水平相对降低，提示Pgp3能中和LL37调控的抑制衣原体作用。进一步研究表明，随着Pgp3浓度升高，其中和作用增强[15]。研究还发现，Pgp3是通过其中间区域(middle region of Pgp3，Pgp3m)与LL37结合形成稳定复合体而中和LL37的抗衣原体活性，再次表明Pgp3能解除抗菌肽对衣原体的杀伤，在衣原体致病中发挥重要作用，且这种中和作用取决于Pgp3的三聚体结构。

2.4 动物模型中的保护作用

近年来，利用小鼠模型对质粒缺失株展开研究，衣原体质粒的致病机制有了突破性进展。Sigar等发现，通过生殖道或呼吸道感染小鼠后，相比质粒完整的野生菌，无质粒的Ct F型菌株的毒性和传染性显著降低。表明在小鼠模型中，质粒缺失能降低Ct的毒性及感染性，而用不含质粒的Cm感染小鼠后Cm感染量也显著降低[16-17]。体内研究表明，衣原体质粒能显著适应并诱导炎症应答，而缺乏质粒的Cm不能诱导免疫病理反应，故小鼠不会出现输卵管疾病[18]。综上所述，Cm和Ct固有质粒能调控小鼠及较低等灵长类动物的毒力及感染率，用质粒蛋白免疫小鼠具有一定的保护作用，而这种保护作用与衣原体质粒编码的8个蛋白有必然联系。

Li等研究表明，用Ct Pgp3 DNA疫苗免疫小鼠对小鼠生殖道衣原体感染具有保护作用[19]。Ramsey等用穿梭载体构建缺失Pgp3的CTL2型菌株，经阴道感染小鼠，研究Pgp3在衣原体致病中的作用。结果发现，相比无质粒的Ct菌株，完整质粒穿梭载体转化的菌株能有效增强感染率并诱导宿主免疫应答，而进一步构建的Pgp3缺失株经小鼠阴道接种后能减少抗体免疫应答和UGT组织的感染率及炎性浸润[20]。Mosolygó等在小鼠皮下注射重组Pgp3和Pgp4蛋白，免疫3次并感染Cm后，发现感染小鼠肺组织中衣原体载量显著降低，同时γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)水平降低[9]；用免疫小鼠获得的血清在体内外进行Cm中和实验，发现小鼠肺组织中Cm数量并未降低，而从免疫小鼠中分离的CD4+脾脏细胞过继转移后，小鼠肺组织衣原体载量显著降低。以上结果表明，Pgp3对衣原体感染有重要作用，主要表现在诱导炎症反应来抵抗衣原体感染，对免疫小鼠具有一定的保护作用，而这种保护作用由CD4+细胞介导。

3 Pgp3是一种免疫优势抗原

Galaleldeen等对Ct的Pgp3结构进行分析，发现该蛋白中有较多的转角与卷曲结构，易与抗体嵌合[6]。由此推测其可能包含相关的优势抗原表位，具备作为候选疫苗的结构特征。此外，一种有效的疫苗可能需满足衣原体感染唯一靶点的特征，并产生保护性免疫应答而无病理性免疫反应。Li等研究表明， Pgp3核酸疫苗能减少衣原体在生殖道组织中的繁殖，并明显减轻衣原体感染小鼠的输卵管局部炎症病理变化，表明Pgp3核酸疫苗对衣原体感染具有一定的免疫保护作用[19]。以上结果提示，Pgp3符合有效疫苗的特征，可作为衣原体疫苗的候选抗原。

Pgp3也是一个理想的衣原体特异性免疫抗原，可能成为衣原体检测的候选诊断抗原。高西波等在筛选Ct感染血清学优势蛋白时发现，在Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、MOMP、IncA和HSP60这10种Ct免疫优势蛋白中，Pgp3、CT694和CT875组合蛋白的血清学实验结果与微量免疫荧光和细胞培养的符合率分别为97.73%(43/44)和92.86%(13/14)，该蛋白组合对Ct筛查的灵敏度最高，特异度最强。其中Pgp3的抗原性最强，抗体检出率最高，表明Pgp3可作为衣原体诊断的候选抗原[21]。Horner等调查发现，用Pgp3双抗原夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测Ct的灵敏度高于传统的间接Pgp3 ELISA，且在大多数感染Ct的妇女体内能检测到Ct 特定的Pgp3抗体[22]。近年来，Pgp3作为抗原检测衣原体感染被广泛应用，并获得世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐。应用Pgp3抗体检测法开展沙眼流行病学调查，可检测沙眼及倒睫症的二次感染率[23]。

4 结语

Pgp3是人类感染衣原体期间的免疫优势抗原，在衣原体致病中起重要作用，是研究衣原体致病机制的重点。随着分子生物学与蛋白质组学技术的发展，国内外学者已研究了Ct的Pgp3基因结构和部分功能。在Ct感染的治疗和诊断方面，目前还没有完善的方案，能否利用Pgp3制作Ct疫苗与诊断抗原，从而为Ct感染防治与诊断开辟新的领域，还需进一步对Pgp3疫苗的有效性、安全性、实用性等进行研究。

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《微生物与感染》编辑部

. WU Yimou, E-mail:yimouwu@sina.com

Progress inChlamydiaplasmid protein Pgp3

TAN Yuan, WU Yimou

InstitutionofPathogenicBiology,MedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Pgp3 is one of the products produced by a small (about 7.5 kb) but highly conserved cryptic plasmid contained in some chlamydiae. This protein is secreted into the cytoplasm of the host cells and known as a virulence factor associated with hydrosalpinx. Its native conformation is a triplex that can be recognized by host immune system. Pgp3 can neutralize the antichlamydial activity of human cathelicidin LL37. This review presents current research progress on the structure, pathogenesis and applications of Pgp3, and provides the new sights in chlamydial pathogenesis and vaccine preparation.

Chlamydia; Pgp3; Plasmid protein; Pathogenesis

国家自然科学基金(81671986)

吴移谋

2016-09-01)