一氧化氮供体纳米复合物的合成与性质研究

王丽颖，杨彦萍，王 丽，王 兵，孙 捷*

(1.山东省电力中心医院，山东 济南 250001；2.青岛经济技术开发区第一人民医院，山东 青岛 266555；3.山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062)

一氧化氮供体纳米复合物的合成与性质研究

王丽颖1*，杨彦萍2，王 丽1，王 兵3，孙 捷3*

(1.山东省电力中心医院，山东 济南 250001；2.青岛经济技术开发区第一人民医院，山东 青岛 266555；3.山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062)

一氧化氮供体纳米复合物由谷胱甘肽(GSH)包覆的Mn掺杂的ZnSe量子点和一氧化氮(NO)光敏供体复合而成.它通过双光子激发诱导RBS分解释放NO可以实现NO的可控释放.本方法顺利实现了静电自组装，合成的纳米复合材料作为智能药物载体具有很大的开发潜力.该量子点纳米复合材料对NO释放采用双光子激发的可控释放，释放的一氧化氮表现出显著的癌症细胞杀伤活性.

量子点；一氧化氮；肿瘤

量子点因为其独特的光学性能和生物医学上的应用，在过去的五年中产生了广泛的关注[1-2].在应用中，量子点显示出可调的、高效的和长时间的光致发光能力，并有超过有机染料和荧光蛋白的灵敏度和分辨率[3].然而，量子点中的有毒重金属离子抑制了其在医学进一步的应用[4].过渡金属离子(如锰)掺杂量子点无重金属离子可以克服传统量子点以上问题.尽管锰离子也有一定的毒性，但相对而言它是可以接受的[4-5].

宽带隙量子点如Mn离子掺杂ZnSe量子点作为新一代发光纳米材料，引起了广泛的关注.但以往的研究主要致力于掺杂Mn离子的ZnSe量子点的合成和光致发光应用[5-8]，关于它的双光子激发荧光(TPEF)特点及相关的应用几乎没有任何报道.双光子激发荧光量子点在化学和生物医学中的应用有其独特优势[9-11].掺杂Mn离子的ZnSe量子点双光子吸收行为在已有文献中有提及[12].但到目前为止，其引起药物释放并杀死癌细胞的报告还没有.

在这里，我们介绍一种多功能纳米复合材料，它是由谷胱甘肽(GSH)包覆的Mn掺杂的ZnSe量子点和一氧化氮(NO)光敏供体复合而成，顺利实现了静电自组装，它通过双光子激发诱导RBS光解释放NO可以实现NO的可控释放.作为智能药物载体具有很大的开发潜力.该量子点纳米复合材料对NO释放采用双光子激发的可控释放，且释放NO具有显著的癌症细胞杀伤活性，经我们的研究证明这归功于NO诱导的对癌细胞的细胞毒性.

作为光敏NO供体，RBS已经在早期的研究报告中报道，在紫外光或可见光波长的照射下RBS光解产生NO的释放[13-15].最近，谭连江等制备壳聚糖包覆掺杂锰的ZnS量子点，然后结合RBS形成量子点 RBS壳聚糖复合材料[16].这些复合材料可以在双光子激发下进行NO的释放，但复合材料的合成相对复杂.此外，此复合材料没有进一步应用于肿瘤治疗领域.相比之下，我们提出的量子点纳米复合材料双光子激发(1 130 nm激光)会引发NO释放.而且释放的NO有着显着的癌细胞毒性.该智能量子点纳米复合材料在双光子激发下有着多种用途，比如利用控制NO释放用于癌症治疗或心脑血管疾病的治疗，这在生物医学应用中有重要意义.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯化锰、亚硒酸钠、谷胱甘肽，麦克林试剂；硝酸锌，阿拉丁试剂；其他为常用分析纯试剂.

昆山舒美超声波清洗器KQ3200，昆山超声仪器有限公司；CW红外激光发射器，光纤通信技术有限公司；79-1磁力搅拌器，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；深度制冷EMCCD-DU897，安道尔科技公司；紫外可见分光光度计U3000，日立有限公司.

1.2 谷胱甘肽包覆的掺杂锰离子的ZnSe量子点的合成

谷胱甘肽包覆的掺杂锰离子的ZnSe量子点的合成使用王超课题组[4]的合成方法.在100 mL三颈烧瓶中加入1 mL 12.5 mol/L的MnCl2溶液，然后通入N2脱气30 min.将新鲜制备的亚硒酸钠溶液加入到N2饱和的氯化锰溶液中，在谷胱甘肽(GSH)作为稳定剂的条件下调节pH至11.随后，反应在氮气保护下回流30 min，温度为95 ℃，然后加入10 mL 12.5 mol/L的Zn(NO3)2溶液继续回流5 h.反应中，锰、硒、锌、谷胱甘肽的物质的量比例为1∶25∶40∶1 200.5 h后，将混合物冷却至室温，再加入锰杂ZnSe量子点继续搅拌可得谷胱甘肽包覆的掺杂锰离子的ZnSe量子点.所得量子点可以采用乙醇沉淀纯化，沉淀物离心分离，用乙醇-水洗涤多次，然后真空干燥.取得的粉末进行表征研究.

1.3 谷胱甘肽包覆的掺杂锰离子的ZnSe量子点与一氧化氮供体纳米复合物的合成

RBS,[ Fe4S3(NO)7]-Roussin Black Salt(陆森黑盐)，是一种一氧化氮供体，可释放NO.根据文献[17]所述的方法进行预处理，将RBS以固体形式放在惰性气体中避光保存.在搅拌和超声下，RBS水溶液10 mL缓慢滴加入量子点的水悬浮液形成量子点-RBS纳米复合材料.不需任何后处理，所得到的量子点-RBS纳米复合材料进行表征和发射光谱的吸收值测定.这些材料可以用乙醇沉淀来纯化，沉淀离心分离，用乙醇-水洗涤多次，然后干燥，在后续的实验中进一步研究.

2 结果与讨论

我们将谷胱甘肽包覆的掺杂锰离子的ZnSe量子点用透射电子显微镜(TEM)进行了表征.所制备的量子点平均粒径为6.7 nm且均匀分散.高分辨率TEM清晰显示了纳米晶体的晶格条纹，晶面间距为0.32 nm.选择性区域电子衍射(SAED)图像表明衍射环与ZnSe闪锌矿相晶格匹配.量子点和纳米复合物的电子自旋共振(ESR)光谱表明二者信号相似.

在静电相互作用下，带负电荷的RBS与带正电的GSH的氨基在量子点表面结合，使QDs-RBS 纳米复合材料形成.我们对量子点的光致发光进行了研究，光致发光的激发光谱在385 nm有最大吸收峰，并且在1 130 nm有一个宽的吸收峰.这两个典型的峰分别源于QDs-RBS 纳米复合材料单光子吸收(SPA)和双光子吸收(TPA)[18].此外，我们记录了QDs-RBS 纳米复合物的单和双光子激发发射光谱.在图1中，无论是单光子和双光子诱导的发射峰都在570 nm.385 nm激光激发的SPA介导发射应为锰离子状态改变产生的.ZnSe量子点的光致发光未观察到，表明锰离子掺杂在量子点内.

图1 QDs-RBS 纳米复合材料单和双光子激发发射光谱Fig.1 Single- and two-photon excited PL emission spectra of QDs-RBS

2.1 QDs-RBS 纳米复合物细胞毒性研究

为评价纳米复合物的细胞毒性，HeLa细胞在10%血清的基本培养液中培养，在细胞培养箱中含有5% 的CO2，温度37 ℃，Hela细胞用胰蛋白酶溶液表面分离，等分后接种到96孔板中.培养24 h后，在37 ℃下，用10 mL含有不同浓度(0,0.01,0.05,0.1,0.5,1 g/L)QDs-RBS和1 g/L的无血清细胞培养基代替原来的培养基.处理后的细胞孵育24 和48 h，在37 ℃下黑暗培养，或1 130 nm激光照射0～12.5 min，经照射的细胞与不照射的低细胞死亡组对比.最后，对HeLa细胞的死亡率，采用MTT法检测[18].

浓度为1 g/L下，相比阴性对照(HeLa细胞无QDs-RBS)超过88% (84%)的HeLa细胞无光照下存活24 h (48 h)，如图2所示.在相同的条件下，不少于87%的HeLa细胞与量子点共培养后存活48 h，这些证明了在黑暗中此纳米复合物的毒性很小.在利用激光器输出的1 130 nm激光照射(0.5 W)后，我们发现HeLa细胞存活率明显降低，如图3所示.特别是12.5 min的连续激光照射导致几乎全部的(不少于98%)HeLa细胞死亡，其阴性对照细胞死亡小于15%.此外，无复合物存在下，在照射功率高达5 W和5 min的连续照射， HeLa细胞存活率为90%.这些结果显示，复合物没有激光照射本身不能诱导显著的细胞毒性，表明其低毒性不影响其在生物医学系统中的应用.

图2 黑暗中与不同浓度QDs-RBS复合物孵育的HeLa细胞的存活率Fig.2 Viabilities of HeLa cells incubated with QDs-RBS of different concentrations in dark

图3 黑暗中与1 130 nm激光照射(0.5 W)下与1.0 g/L的QDs-RBS复合物孵育的HeLa细胞存活率Fig.3 Viabilities of HeLa cells incubated with 1.0 g/L of QDs-RBS,in dark and under irradiation with a 1 130 nm laser of 0.5 W

2.2 QDs-RBS 纳米复合物稳定性研究

QDs-RBS纳米复合物稳定性研究需要记录TPEF光谱测量和相应的TPEF荧光强度.一个0～5 W可调连续波CW红外激光发射器(1 130 nm)作为激光源和一个 Andor DU897 EMCCD作为信号采集器.纳米复合材料的水悬浮液是由CW红外激光在1 130 nm聚焦照射，TPEF荧光强度在500～650 nm波段记录.具体来说，为探讨该量子点纳米复合物的稳定性，复合物的水悬浮液(50 g/L)是在1 mmol/L PBS溶液(pH 7.4)和胎牛血清(10%)中37 ℃孵育[19-20].用1 130 nm激光照射(0.5 W)，记录在不同的时间间隔(0～72 h)下复合物的TPEF荧光强度.此外，QDs-RBS的水悬浮液(50 g/L)也用2.5 W的激光持续照射，在不同的时间间隔检测(0～2 h).

实验结果证明，当照射激光(2.5 W)达2 h，QDs-RBS的TPEF强度变为原始值的91%，这揭示了该材料低光漂白性能.QDs-RBS 复合材料在磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清(FBS)中孵育72 h后， TPEF没有显著的下降(小于12%)，也没有明显的聚集或沉淀.上述结果说明了复合物的稳定性，从而意味着该纳米复合材料有潜在的生物医学应用前景.

2.3 NO浓度的研究方法

为确定水溶性介质(PBS,10 mmol/L,pH 7.4)中NO释放速度，我们使用格里斯比色反应来测量PBS中的亚硝酸盐或硝酸盐含量[21-26].测定方法是将含有复合物(1.0 g /L,5 mL) 的等量PBS溶液放入离心管在37 ℃水浴搅拌，分别用激光器输出的1 130 nm激光照射(用不同的0～2.5 W辐射功率以及不同照射时间).经过适当的时间，将PBS溶液离心10 min，取上清液(0.5 mL)，加入适量PBS，然后加入格里斯试剂组合(I)和格里斯试剂(II).之后，所得到的混合物溶液在室温下避光孵育15 min，紫红色的颜色立即出现.用紫外可见光分光光度计在540 nm下记录每个样品溶液的吸光值.通过测定亚硝酸钠的吸光度测定的标准曲线(0～100 umol/L)，计算NO的总释放量.

算法如下所示:

R1=c1×0.005;

R2=c2×0.005 +c1×0.001;

R3=c3×0.005 +(c2+c1)×0.001;

.......

Rn=cn×0.005 +(cn-1+cn-2+……+c1)× 0.001

Rn表示NO总量，cn表示NO浓度.

实验结果表明，照射的激光在不同功率的0.5～2.5 W下， NO释放浓度随激光功率的增加而增加，如图4所示.没有激光照射(0 W，在黑暗中)，几乎没有检测到NO，表明无NO释放.在NO的达到最大浓度后，开始缓慢减少，在较低的功率照射下，减少是不太明显的.减少是由于NO的氧化.控制NO释放的“开关”是1 130 nm激光照射(0.5 W).连续照射2.5 min后，释放NO的浓度被记录.停止照射2.5 min后，RBS的量子点纳米复合材料再次连续照射2.5 min.如图5所示，NO释放曲线变为梯度，表示激光照射下该材料具有响应快、重复疲劳影响小的特点.

图4 不同照射功率下NO释放示意图Fig.4 Concentrations of NO released from QDs-RBS under irradiation of different irradiation powers

图5 激光照射下QDs-RBS复合物释放NO“开-关”示意图Fig.5 “On-off” release behavior of NO from QDs-RBS in PBS irradiated by the laser

3 结论

研究了1 130 nm激光连续照射下TPEF诱导的NO释放行为并进行了NO的定量检测，研究结果表明激光照射下QDs-RBS复合物具有响应快、可持续释放的特点.稳定性研究的结果说明了复合物的稳定性，从而意味着该纳米复合材料有潜在的生物医学应用前景，用MTT试验检查该纳米复合材料的细胞毒性.发现复合物在激光照射下具有很强的细胞毒性，而没有激光照射下其本身不能诱导显著的细胞毒性，这些实验结果表明上述细胞的死亡主要是由于光触发NO释放，其材料本身的低毒性不足以杀死细胞，故不影响其在生物医学系统中的应用.在1 130 nm激光辐照下，QDs-RBS复合物产生TPEF (约570 nm)，导致TPEF介导的RBS光解和NO的释放，且产生的NO导致明显的细胞毒性.这说明所合成的材料可以实现NO光控释放和NO介导的癌症治疗.

综上所述，本文报道了通过静电相互作用的QDs-RBS的合成方法.并证明了该材料可以用于NO光控释放.对该材料对其他疾病的治疗作用，比如和NO有关的心脑血管疾病及炎症，将做进一步的研究.

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[责任编辑：刘红玲]

Synthesis and properties study of nitric oxide donor nanocomposites

WANG Liying1*,YANG Yanping2,WANG Li1,WANG Bing3,SUN Jie3*

(1.ShandongElectricPowerCentralHospital,Jinan250001,Shandong,China;2.TheFirstPeople’sHospitalofQingdaoEconomicandTechnologicalDevelopmentZone,Qingdao266555,Shandong,China;3.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China)

A multi-functional nano-composite material was prepared by composing glutathione (GSH) coated Mn-doped ZnSe quantum dots,and nitric oxide (NO) donor photosensitive composite.RBS induced by two-photon excitation can decompose to release NO to a monageable size.This method successfully realized electrostatic self-assembly,and a smart drug carriers has great potential for development.The quantum dot nanocomposites with controlled release of NO release of two-photon excitation.The releasing nitric oxide exhibit significant cancer cell killing activity.

chitosan quantum dots; nitric oxide; tumor

2016-09-27.

山东省自然科学基金(ZR2015YL041).

王丽颖(1981-)，女，硕士生，研究方向为心脑血管疾病.*

，E-mail：635775299@qq.com.

O62

A

1008-1011(2017)01-0108-05