临床菌株耐药性分子检测技术的应用进展

梁有才综述，陆学东审校(.广东医科大学研究生学院，广东湛江 534000； .中山大学附属第八医院检验医学部，广东深圳 58033)

·综述·

临床菌株耐药性分子检测技术的应用进展

梁有才1综述，陆学东2审校
(1.广东医科大学研究生学院，广东湛江 534000； 2.中山大学附属第八医院检验医学部，广东深圳 518033)

临床菌株分子检测技术发展迅速。实时荧光定量PCR的应用已较为成熟；基因芯片、多重基因遗传信息表达分析系统对部分菌株耐药基因检测的方法已经建立；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在菌株蛋白质分子及单核苷酸突变检测方面有独特优势；最新一代DNA测序技术在简化实验流程的同时大幅削减成本，其应用可能为临床菌株鉴定及其耐药性检测带来新的革命。该文对上述几种分子检测技术在临床菌株耐药检测方面进行介绍，为临床应用与研究提供参考。

细菌；耐药基因；聚合酶链反应；多重基因分析系统；MALDI-TOF MS；DNA测序

基因检测具有快速、可预测菌株潜在耐药性的优点，对临床重症感染紧急用药治疗具有指导意义，甚至有可能成为某些病原菌耐药检测的标准[1-2]。近年来，分子生物学技术的进步带动了临床菌株分子检测技术的迅速发展。本研究对PCR、基因芯片(gene chip)、多重基因遗传信息表达分析系统(gene expression profiler genetic analysis system, GeXP)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)、DNA测序(DNA sequencing)这5种重要的分子检测技术进行综述，为相关应用与研究提供参考。

1 PCR技术

多种PCR技术均可用于微生物检测，包括巢式PCR、数字PCR、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、重复序列PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR(real time fluorescene quantitative PCR，Real-time PCR)等。其中，Real-time PCR在临床菌株耐药基因检测方面的应用比较成熟。Wang等[3]应用Real-time PCR检测血培养液中甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌基因16S rRNA(细菌感染内参)、nuc(金黄色葡萄球菌共有基因)与mecA(甲氧西林耐药相关基因)，敏感性依次为100%、97.2%和99.2%，特异性均为100%，最低细菌检测浓度为103CFU/mL。Van等[4]应用Real-time PCR检测革兰阴性杆菌耐药基因blaOXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM与blaKPC，筛查58株产碳青霉烯酶菌株与28株阴性质控株，敏感性与特异性均为100%。Peng等[5]应用多荧光实时定量荧光PCR(multi-fluorescence quantitative Real-time PCR)技术检测结核分枝杆菌rpoB、katG、mabA-inhA和oxyR-ahpC基因突变导致的耐药，鉴别利福平耐药与药敏试验相比，敏感性与特异性分别为94.6%与100%，与DNA测序相比分别为97.2%与100%；鉴别异烟肼耐药与药敏试验相比，敏感性与特异性分别85.9%与95.3%；与DNA测序相比分别为97.9%与96.4%。该技术同时检测结核分枝杆菌保守基因rrS来鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，准确率达100%，扩增过程仅需2.5 h。

Real-time PCR优点为：(1)灵敏度高，可定量分析；(2)具有引物与探针(或者染料)的双重特异性，比传统PCR特异性好；(3)在封闭管内一步完成检测，自动化程度高，不易交叉污染或污染环境。缺点为：(1)不能检测扩增产物大小；(2)由于荧光素种类及检测光源局限，复合式(multiplex)检测能力受限；(3)引物难以设计，反应中引物相互干扰，降低扩增效率。

2 基因芯片技术

固相芯片也称DNA微阵列(DNA microarray)，基本原理是将已知序列的寡核苷酸探针固定在固相支持物表面；DNA样品经PCR扩增后被荧光标记，与芯片上寡核苷酸探针杂交；通过检测杂交信号进行定性与定量分析。该技术在菌株鉴定及耐药基因检测方面较Real-time PCR通量更高。Ting等[6]应用固相芯片技术检测细菌β-内酰胺类耐药相关基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaDHA、blaCIT、blaVIM、blaKPC与blaOXA-23，检测结果与传统PCR一致，敏感性与特异性均为100%。Boqaerts等[7]应用固相芯片技术检测革兰阴性杆菌超广谱β-内酰胺类耐药基因(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaBEL、blaPER、blaGES和blaVEB)、头孢菌素类耐药基因(blaCMY-2-like、blaDHA、blaFOX、blaACC-1、blaACT/MIR和blaCMY-1-like/MOX)以及碳青霉烯类耐药基因(blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP、blaNDM、blaGIM、blaSPM、blaOXA-23、blaOXA-24和blaOXA-58)，敏感性依次为100%、99.5%和100%，特异性均为100%；还能将产超广谱β-内酰胺酶与产碳青霉烯酶菌株进行有效鉴别，检测48株菌用时仅需7～8 h。固相芯片可包含成千上万种DNA探针，检测通量明显提高；可分析小片段缺失与插入，敏感性比PCR+琼脂糖电泳高10倍[8]。但在芯片表面原位合成核酸探针时易发生错误或混入杂质而降低杂交特异性。目前固相芯片可检测项目还比较少，尚难以广泛应用。

液相芯片也称为微球体悬浮芯片(liquid chip，suspension array)，主要包括Luminex公司推出的Luminnex 100/200和Flexmap 3D技术平台。Luminex 100/200系统用红色与橙色荧光染料将聚苯乙烯微球染成不同色彩后标记核酸探针，在悬液中样品分子(PCR产物)特异结合报告分子与微球探针，经过流式细胞仪时被激光激发出荧光，经检测系统进行定性或定量分析。Flexmap 3D加入3种不同荧光素，检测分子数从100提高到500，多方面提高检测能力及效率[9]。李婧婵等[10]基于Luminex 200平台结合等位基因特异性引物延伸技术，建立检测结核分枝杆菌耐药基因突变位点rpoB526、katG315、ropB531的方法，在样本浓度为1.5×105ng/mL时，批间和批内变异系数(CV)分别为6.48%～12.15%和0.35%～6.92%；在样本浓度为2 ng/mL时，批间和批内CV分别为5.73%～10.77%和0.97%～8.91%；重复性好；最低检测浓度可达1 ng/mL，且多位点检测互不干扰；1人在8 h内可完成上百例样本的多突变位点检测。液相芯片灵敏度高，最低检测浓度达0.1 pg/mL，克服了固相芯片检测大分子易受动力学指标干扰的缺点，线性范围可达0.2～32 000 pg/mL。Flexmap 3D理论上能够在20 min内对96个样本的500种目的分子同时定性或定量检测，PCR 扩增后1 h即可得到结果[9]。但是，液相芯片技术应用能力受PCR多重扩增能力限制,仪器价格昂贵，临床推广有难度。

3 GeXP技术

GeXP系统融合多重PCR与毛细管电泳分离技术，采用荧光标记的通用引物和末端连有通用引物标签的特异性嵌合引物，反应起始由反向嵌合引物与RNA模板逆转录出cDNA(DNA样品无此步骤)，cDNA与正向嵌合引物结合，扩增出通用互补序列，再由通用引物与之结合扩增出荧光标记产物，经毛细管电泳分离，与标准DNA(DNA size standard)迁移对比可计算扩增片段大小，可定量检测荧光强度,反映扩增片段含量。

GeXP系统可应用于菌株鉴定及耐药基因分析。吴金燕等[11]应用GeXP系统检测白假丝酵母菌参照基因ITS及其与氟康唑耐药相关的ADH1、ERG11、CDR2、CDR1、FLU1、MDR1和ERG3基因，灵敏度达102拷贝/μL。研究发现除了ADH1与FLU1，其余6种基因从热带假丝酵母菌氟康唑耐药株中检出的浓度不同程度地高于敏感株。Hu等[12]应用GeXP系统检测细菌氨基糖苷类耐药相关基因aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、aac(6′)-Ⅱ、ant(3′)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅵ、armA和rmtB，与传统PCR相比，敏感性依次为92.5%、100%、88.89%、100%、83.33%、95.24%和93.33%。

GeXP系统相比PCR+琼脂糖凝胶电泳有诸多优势：(1)可分辨相差5 nt基因片段，提高了分辨率；(2)一个反应可从5～500 ng RNA样本中同时检测30～40个基因，提高了效率；(3)可分辨0.5倍基因表达量变化，提高了灵敏度；(4)将多基因整合在同一体系分析，消除分管操作和孔间误差，提高了准确性与可重复性[13]。GeXP系统也有缺陷：(1)靶序列浓度差异过大，易导致低浓度序列检测假阴性；(2)为避免扩增偏倚，目的片段需控制在150～350 bp之间；(3)每对引物需逐一优化调整；(4)最后判读峰图尚无固定标准。

4 MALDI-TOF MS技术

MALDI-TOF MS利用激光激发样本(蛋白质分子或核酸分子)与基质的结晶产生离子，离子进入真空管后，其质荷比与飞行时间成正比，由质谱仪探测绘成质谱峰图，比对参考图谱即可辨别样本分子。MALDI-TOF MS可通过分析菌株核蛋白获得特征峰(蛋白质指纹图谱)来鉴别菌株及其耐药性。例如Wang等[14]应用MALDI-TOF MS鉴别金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)菌株在3 784～5 700区间有区别于MSSA菌株的特征峰，该检测过程仅需30 min，仪器自动检测靶板上96例样本仅须2 h，与PCR及表型检测法相比准确率为97%。Sparbier等[15]将金黄色葡萄球菌接种在含苯唑西林与同位素标记赖氨酸的培养基中，MRSA菌株利用赖氨酸合成菌体蛋白，而MSSA菌株由于抗生素压力未获合成，导致两者的MALDI-TOF MS检测图谱有特征性区别，鉴别结果与表型检测法(E-test法)一致。此外，MALDI-TOF MS还可根据菌株酶解抗生素分子的改变[16]以及菌株外膜蛋白的改变[17]来分析其耐药性。

在核酸检测方面，MALDI-TOF MS与PCR相结合的微测序法(mini sequencing)可以检测单核苷酸多态性(SNP)突变导致的耐药。基本流程为：PCR扩增模板核酸，虾碱性磷酸酶(SAP)处理产物，再利用单核苷酸引物延伸技术扩增，阳离子交换树脂纯化产物，再MALDI-TOF MS分析。延伸产物比引物多一个碱基，该碱基依SNP位点碱基改变而改变(互补配对)，产物分子量因此不同，导致MALDI-TOF MS检测图谱的特征性改变，以此判断SNP的存在。Ikryannikowa等[18-19]利用该方法检测大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌blaTEM基因突变以及结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变所导致的耐药，结果与DNA测序一致。

MALDI-TOF MS鉴定微生物与传统培养法相比，具有快速、灵敏、高通量、检测成本低等优势，但其无法对样品定量；仪器成本高；结果判读无固定标准；基于蛋白质指纹的耐药检测目前仅适用少部分菌株；在核酸检测时，PCR体系中的离子会影响质谱分辨率和信号强度；基因突变检测效益尚未明确，相关试剂成本高，距离临床推广尚有段距离。

5 DNA测序技术

第一代DNA测序技术是指传统的化学降解法与双脱氧链终止法(Sanger法)以及以其为基础发展而来的各种DNA测序技术。第一代测序技术原始数据准确性高达99.999%，读长达1 000 bp；但成本高，速度慢，通量低，影响基因组测序效率。第二代测序技术(next-generation sequencing)主要包括Roche、Illumina和ABI公司的454、Solexa和SOLiD平台[20]，相对前一代技术成本低，通量高，一次测序可读取100 000～1 000 000条序列，准确率至少可达99.5%；但读长较短(454技术可达700 bp)，任何影响PCR扩增的因素皆可影响测序结果的准确性。第三代测序技术[21](next-next-generation sequencing)是单分子测序技术，包括：Heloscope BIoScience、Pacific BioSciences、VisiGen Biotechnologies、Life Technologies和Oxford Nanopore technologies 5个公司分别拥有的SMS、SMRT、FRET、Ion Torrent PGM和新型纳米孔测序技术。第三代测序技术无需PCR扩增，实现超长读长；以SMRT为代表，读长可达3 000 bp，但错误可达15%。Nanopore新型纳米孔技术[22-23]弃用以往的聚合酶生化反应，以分析电参数特征来分辨碱基种类，速度可达20～400 nt/s，该技术的发展有望改变第三代测序准确性偏低的缺点。

第二代测序技术在实现高通量的同时降低成本，使通过测序大规模获取基因组数据成为可能。经DNA测序分析菌株全基因组或特定基因片段可以鉴别细菌及其耐药基因。Cordon等[24]采用基因组测序筛查491株金黄色葡萄球菌的24种耐药基因(与12种抗生素相关)，与表型检测相比，敏感性与特异性分别为97%(95%CI:0.95～0.98)和99%(95%CI:0.99～1)。Cloman等[25]未经细菌培养，直接提取痰标本中细菌基因组核酸，经测序检测结核分枝杆菌7种抗生素相关耐药基因，与表型检测的符合率为97%。此外，Laabei等[26]对90株MRSA进行基因组测序研究，发现121个基因位点与菌株致病毒力相关，基于上述位点建立起菌株毒力预测模型,可将临床感染菌株行基因组测序与该模型比对，为临床诊治提供有力证据。

6 展望

PCR技术仍然是临床应用较成熟的耐药基因检测技术，基因芯片与GeXP技术研究主要在方法建立阶段。MALDI-TOF MS具备直接检测临床样本中病原菌的能力，但在细菌耐药性检测方面仍存在诸多难以解决的问题。上述技术应用于细菌耐药基因检测需在核酸提取与PCR扩增之后进行，操作繁琐，最终结果的确认有赖于DNA测序。第三代DNA测序技术无需PCR扩增，在数十分钟内可完成基因组测序；同时可进行菌株鉴定及分型、耐药基因谱筛查、毒力基因谱筛查以及基因突变分析。随着病原菌耐药基因与临床耐药机制关系的逐步明了，测序技术的进一步发展以及检测成本的进一步下降，新一代测序技术有望在临床推广应用，为临床病原菌感染的诊断治疗带来革命性前景。

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(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.17

梁有才，1986年生，男，技师，硕士研究生，主要从事微生物检验工作。

陆学东，研究员，硕士研究生导师，E-mail:luxuedong2004@163.com。

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2016-10-25)