甜菜碱对铜绿假单胞菌生物膜形成与分散及耐药性的影响*

夏文颖，王珏，金菲，许雨乔，倪芳，赵旺胜(南京医科大学第一附属医院检验学部，南京 210029)

·微生物生物膜·

甜菜碱对铜绿假单胞菌生物膜形成与分散及耐药性的影响*

夏文颖，王珏，金菲，许雨乔，倪芳，赵旺胜
(南京医科大学第一附属医院检验学部，南京 210029)

目的 探讨甜菜碱对铜绿假单胞菌生物膜形成抑制及分散的作用，及其生物膜的形成与抑制对铜绿假单胞菌耐药性的影响。方法 收集20株临床铜绿假单胞菌，采用结晶紫染色法进行生物膜形成能力试验及甜菜碱对铜绿假单胞菌的生物膜抑制与分散试验，并比较铜绿假单胞菌在生物膜形成与抑制情况下对环丙沙星的最低抑菌浓度(MIC)变化。结果 20株铜绿假单胞菌均形成生物膜，24 h时即可形成成熟生物膜，吸光度(A590 nm)为1.90±0.66。与对照组比较，甜菜碱作用24 h则可明显抑制铜绿假单胞菌生物膜形成(t=4.36,P<0.01)，48 h可达最大抑制作用，A590 nm为1.12 ±0.60；甜菜碱对铜绿假单胞菌的成熟生物膜分散作用24 h即可达最大分散作用。环丙沙星对20株铜绿假单胞菌MIC范围0.03～4 μg/mL，MIC50为0.25 μg/mL，MIC90为2 μg/mL，甜菜碱抑制生物膜后环丙沙星MIC无变化。形成成熟生物膜后环丙沙星MIC均大于16 μg/mL。结论 甜菜碱可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成并能分散成熟生物膜，为临床感染的治疗带来更多选择。环丙沙星在有甜菜碱参与抑制时，对产膜细菌杀菌效果无变化。

生物膜；铜绿假单胞菌；甜菜碱；环丙沙星

细菌生物膜(bacteria biofilm，BBF)是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。BBF的存在使细菌的耐药性比浮游菌增加了10～1 000 倍，且抗生素应用难以清除BBF，还会诱导耐药性的产生。目前生物膜引起的微生物耐药现象明显增加，是临床上难治性感染的重要原因之一[1]。铜绿假单胞菌被认为是产生物膜微生物中对人类危害最严重的一种[2]，常见于肺部囊性纤维化、伤口慢性感染、导管相关感染和戴隐形眼镜引起的角膜炎等[3]。甜菜碱(betaine)又名三甲基甘氨酸，是一种季铵型水溶性生物碱，具有良好的杀菌消炎作用，有研究证实甜菜碱具有抑制微生物过度增殖的作用[4]。本研究旨在探讨甜菜碱在体外对铜绿假单胞菌生物膜形成与分散的影响，以及其对细菌耐药性的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 20株临床分离的铜绿假单胞菌均分离自2016年5月至6月我院住院患者治疗前采集的下呼吸道标本，剔除同一患者的重复菌株。Vitek 2 Compact 全自动微生物分析系统对其进行鉴定和药敏分析。药敏结果按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S26[5]规定判读。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2 试剂与仪器 结晶紫溶液：结晶紫饱和液(结晶紫2 g溶于100 mL 95%乙醇)20 mL+10 g/L草酸按溶液(草酸铵10 g加温溶解于1 L蒸馏水)80 mL，混匀后用中速滤纸过滤后置于棕色瓶中备用。96%甜菜碱(南京明生医药技术有限公司)；环丙沙星(广东南新制药有限公司)；Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统、DESICHECK比浊仪(法国生物梅里埃公司)；96孔细胞培养板(美国 Corning/Coster公司)；SHA-B全自动恒温震荡仪(金坛市国华仪器厂)；Thermo 自动酶联仪(美国Thermo公司)。

1.3 生物膜形成能力测定 采用结晶紫染色法[6]检测。挑取新鲜铜绿假单胞菌单个菌落于4 mL LB培养基中，35 ℃、120 r/min培养24 h，将上述菌液浓度调整至0.5麦氏浊度单位，1∶100稀释后加入96孔板，每孔加100 μL，同时每孔加LB培养液100 μL，每株菌做3个复孔，以LB培养液作空白对照，35 ℃培养24 h、48 h和72 h。吸去96孔板内的培养液，加入200 μL结晶紫溶液染色15 min，弃染色液并用PBS冲洗3次，室温干燥后加入200 μL 95%乙醇，用酶联仪测590 nm处吸光度(A590 nm)，重复3次，取平均值。以空白对照孔的平均值+3倍空白对照的标准差作为cut off值(Ac)。若实验组的A590 nm≤Ac，则成膜能力阴性；若A590 nm>Ac，则成膜能力阳性。

1.4 铜绿假单胞菌生物膜抑制试验 0.5麦氏浊度单位铜绿假单胞菌菌悬液制备同1.3操作，1∶100稀释后加入96孔板，每孔加100 μL，同时每孔加2.0 g/L甜菜碱100 μL，每株菌做3个复孔，以含有相同终浓度菌悬液的LB培养液作实验对照，以LB培养液作空白对照，35 ℃培养24 h、48 h和72 h。采用结晶紫染色法检测细菌生物膜A590 nm。

1.5 铜绿假单胞菌生物膜分散试验[7]0.5麦氏浊度单位铜绿假单胞菌菌悬液制备同1.3操作，1∶100稀释后加入96孔板，每孔加100 μL，每株菌做3个复孔，以含有相同终浓度菌悬液的LB培养液作实验对照，以LB培养液作空白对照，35 ℃培养24 h后，用PBS清洗3遍以去除浮游菌后，每孔加1.0 g/L甜菜碱100 μL，35 ℃培养24 h、48 h和72 h。采用结晶紫染色法检测细菌生物膜A590 nm。

1.6 铜绿假单胞菌生物膜形成与抑制对细菌耐药性的影响 环丙沙星对铜绿假单胞菌最低抑菌浓度(MIC)试验共设置常规组、生物膜组和生物膜抑制组3组。常规组：0.5麦氏浊度单位铜绿假单胞菌菌悬液制备同1.3操作，1∶100稀释后加入96孔板，每孔加100 μL，将环丙沙星倍比稀释配制成2倍终浓度的药液分别加入96孔板孔内，最高终浓度为16 μg/mL，每孔加100 μL，35 ℃培养24 h，观察结果；生物膜组：同常规MIC组将菌液加入96孔板后，温育24 h待形成生物膜后，PBS清洗3遍以去除浮游菌，测定环丙沙星对细菌的MIC值；生物膜抑制组：0.5麦氏浊度单位铜绿假单胞菌菌悬液制备同1.3操作，1∶50稀释后加入96孔板，每孔加50 μL，再加入4.0 g/L甜菜碱50 μL，将环丙沙星倍比稀释配制成2倍终浓度的药液分别加入96孔板孔内，最高终浓度为16 μg/mL，每孔加100 μL，35 ℃培养24 h，测定环丙沙星对加入生物膜抑制剂后的细菌的MIC值。结果按照CLSI[5]规定判读。

1.7 统计学分析 用SPSS 19.0软件进行。生物膜形成能力A590 nm数据呈正态分布，以均值±标准差表示，差异比较进行t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌生物膜形成能力 20株临床分离铜绿假单胞菌均形成生物膜，24 h、48 h和72 h后检测A590 nm值分别为1.90±0.66、1.82±0.69和1.44±0.73，24 h、48 h时生物膜形成能力与72 h时比较，差异有统计学意义(t值分别为3.08和3.31,P均<0.01)，24 h与48 h时成膜能力差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 甜菜碱对铜绿假单胞菌生物膜抑制及分散作用 与未加甜菜碱的实验对照组相比，甜菜碱作用铜绿假单胞菌24 h、48 h和72 h后，A590 nm值均显著下降(t值分别为4.36、4.21和3.21，P均<0.01)；甜菜碱作用48 h、72 h时A590 nm值低于作用24 h时(t=3.61，P<0.01；t=2.33，P=0.04)，48 h时为最低。从2.1实验结果得知显示铜绿假单胞菌24 h即形成成熟生物膜，因而将铜绿假单胞菌24 h生物膜A590 nm值与甜菜碱分散成熟生物膜24 h、48 h和72 h的A590 nm值比较，结果显示甜菜碱分散生物膜的3个时间点A590 nm值均显著低于对照生物膜A590 nm值(t分别为5.76、3.71和3.70，P均<0.01)，分散不同时间点间差异无统计学意义。见表1。

注：*，与相同时间点对照组比较差异有统计学意义；#，与24 h对照组比较差异有统计学意义；△，与抑制作用24 h组比较差异有统计学意义。

2.3 铜绿假单胞菌生物膜形成与抑制对其耐药性的影响 常规组中，20株铜绿假单胞菌对环丙沙星MIC范围为：0.03～4 μg/mL，MIC50为0.25 μg/mL，MIC90为2 μg/mL，16株环丙沙星敏感，2株环丙沙星耐药；生物膜抑制组MIC值与常规组完全一致；生物膜组铜绿假单胞菌MIC值均大于16 μg/mL。

3 讨论

本研究中20株铜绿假单胞菌均形成生物膜，进一步证实铜绿假单胞菌较强的成膜能力。本研究中铜绿假单胞菌24 h即可形成成熟生物膜，48 h与24 h成膜能力差异无统计学意义，72 h生物膜则开始衰减，这与其他研究所证实的指数生长期、平台期及衰退期时间范围基本一致[8]。

甜菜碱广泛存在于动植物、微生物体内，可从甜菜制糖后的废糖蜜中提取，也可采用三甲胺和氯乙酸为主要原料进行化学合成[9]。之前对甜菜碱的研究主要集中在对抗高同型半胱氨酸综合征，能保肝护肾、保持心脏与血管健康、保护细胞抵抗高渗、促进脂肪代谢等。近年来有文献报道甜菜碱能降低炎症因子IL-6和TNF-α的表达，显示其具有降低炎症相关疾病发病率的潜力[10]。陈云霞等[4]证实甜菜碱具有抑制微生物过度增殖的作用。本研究结果证实甜菜碱在对铜绿假单胞菌生物膜的抑制形成及分散中也能发挥很好的作用，甜菜碱可在24 h内即发挥显著的生物膜抑制作用，48 h后抑制作用达到最大值，使得铜绿假单胞菌的生物膜A590 nm值达到最低值；对成熟生物膜的分散试验结果显示，甜菜碱作用24 h后达到最大分散效果。以上结果证实甜菜碱可用于体外抑制及分散细菌生物膜，但其作用机制有待进一步研究。

本研究结果显示铜绿假单胞菌生物膜形成后，环丙沙星MIC值增高。细菌形成生物膜后耐药性明显增加，一旦生物膜形成，在其内部的病原菌抗原靶点则被覆盖，降低了人体免疫监视的敏感性，再加上生物膜耐药屏障的存在，导致外界的抗生素无法有效渗入膜内达到抗菌效果。本研究中使用甜菜碱作为抑制剂时环丙沙星的杀菌作用未有加强效应，可能由于甜菜碱只用于抑制与分散生物膜，利于抗生素渗入膜内，而对药物的杀菌作用未有帮助。后续研究将关注不同浓度的甜菜碱在体内抑制及分散细菌生物膜的作用及其作用机制，以期为临床感染治疗提供更准确的使用依据。

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(本文编辑：刘群)

Effects of betaine on formation and dispersion ofPseudomonasaeruginosabiofilm and its drug-resistance

XIAWen-Ying,WANGJue,JINFei,XUYu-Qiao,NIFang,ZHAOWang-sheng
(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To investigate the effects of betaine on the formation and dispersion of biofilm ofPseudomonasaeruginosaand its drug-resistance. Methods A total of 20 strains ofPseudomonasaeruginosawere obtained from clinical inpatients. The biofilm formation abilities of thePseudomonasaeruginosawere evaluated by violet staining, and the effects of betaine on the formation and dispersion of biofilm were studied. The minimum inhibitory concentration(MIC) values ofPseudomonasaeruginosaon ciprofloxacin were compared with the controls when biofilm was formed and inhibited. Results Biofilm was formed in all the 20 strains ofPseudomonasaeruginosain 24 hours with absorbance(A590 nm)(1.90±0.66). Betaine significantly inhibited biofilm formation ofPseudomonasaeruginosain 24 hours compared with control group(t=4.36,P<0.01) and the maximum inhibition reached in 48 hours with absorbance(A590 nm)(1.12±0.60). The maximum dispersion of betaine on mature biofilm ofPseudomonasaeruginosareached in 24 hours. The MIC range of ciprofloxacin to the 20 strains ofPseudomonasaeruginosawas 0.03 to 4 μg/mL with 0.25 μg/mL of MIC50and 2 μg/mL of MIC90. After the biofilm was inhibited by belaine, the MIC of ciprofloxacin toPseudomonasaeruginosadid not changed. The MIC of ciprofloxacin to biofilm-formedPseudomonasaeruginosawas more than 16 μg/mL. Conclusion Betaine could effectively inhibit the formation of biofilm and disperse the mature biofilm ofPseudomonasaeruginosa, which may provide more choices for the treatment of clinical infection. The germicidal efficacy of ciprofloxacin has no changed on the biofilm-formed bacteria when inhibition of betaine was involved.

biofilm;Pseudomonasaeruginosa; betaine; ciprofloxacin

江苏省实验诊断学重点实验室基金(xk201114)；南京医科大学“十二五”教育研究课题(JYY2015020)。

夏文颖，1986年生，女，硕士，研究方向为感染与肿瘤的诊断研究。

赵旺胜，主任技师，E-mail：zwsjsph@sohu.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.05

R446.5

A

2017-02-01)