生物膜研究相关进展

林迪，孙长贵(解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

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生物膜研究相关进展

林迪，孙长贵
(解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

生物膜是微生物为了适应生存环境，被自身产生的胞外聚合物包裹的高度密集微生物群体。大部分细菌和真菌感染都与生物膜相关。生物膜的形成不仅降低了抗菌药物的疗效，增加了微生物对抗菌药物的耐药性，并且能够帮助微生物逃脱宿主的免疫攻击，从而容易造成治疗过程中或是治愈后感染的复发，严重威胁着人类的健康。该文就生物膜概念及形成机制、生物膜与相关感染、生物膜与微生物耐药性、生物膜实验室检测及其防治作简要综述。

生物膜；微生物；耐药性；感染

美国国立卫生研究院估计，超过60%的微生物感染有生物膜(biofilm)的参与，其大幅度降低了抗菌药物的疗效，并削弱了患者的免疫防御功能，使抗感染治疗变得极其困难[1]。20世纪70年代，生物膜研究的先驱William J.Costerton首先介绍了生物膜的概念。虽然最初的研究只限于体外以及环境中细菌，但随着生物膜相关危害的严重性日益被认识，对生物膜的研究越来越多，更多的研究关注于微生物感染过程中形成的医学生物膜[2]。本文就生物膜概念、生物膜相关疾病、生物膜与微生物耐药性、生物膜实验室检测及其防治作简要综述。

1　生物膜概念及形成机制

目前普遍认为生物膜是微生物被自身分泌的水合多聚物包裹，覆盖于固体表面含有微生物集落的黏性膜层，可由单一菌种形成，也可由多菌种形成，是微生物抵抗不利环境的一种不可逆的生存方式。其与浮游(悬浮或自由浮动)状态下的微生物有显著的区别，如表型变异、基因转录及代谢机制的改变等方面[3-5]。生物膜形成的基本要素有固体物表、高度密集的微生物(近似每毫升含水生物膜中有1010个细胞)、胞外聚合物(extracellular polymer, EPS)与胞外黏性基质、各种复杂的理化过程以及微生物群落之间的相互作用，但是并非所有的生物膜都具有这些特点。其中，EPS由微生物自身产生，是生物膜的主要成分，由胞外多糖、聚糖醛酸、蛋白质、核酸以及脂质构成[5]。

生物膜的形成是一个层递、动态的过程，各种不同的物理、化学、遗传、生物作用都参与生物膜的最终成熟。虽然生物膜形成机制没有清楚的定义，但至少涉及以下5个步骤。(1)可逆性附着：微生物依靠细胞表面电荷、范德华力、疏水性和静电力等可逆性附着于物体表面。(2)产生群体感应(quorom sensing，QS)系统和EPS，形成不可逆附着：微生物聚集、黏附于有生命或无生命物体表面后表达特定的QS分子进行基因调控。目前已确定的控制微生物生物膜形成的QS系统有4种，其中革兰阴性细菌具有自诱导物1(autoinducer-1, AI-1)和自诱导物3(autoinducer-3, AI-3),革兰阳性细菌有自诱导信号肽(autoinducing peptide, AIP)，可负责种内通信；革兰阴性和革兰阳性细菌均表达自诱导物2(autoinducer-2, AI-2)，可负责种间细胞通信。当自诱导物分子表达达到临界浓度，就会在微生物菌落表面形成EPS，从而保护细胞并将其附着于物表。(3)微菌落形成：EPS形成后，大多数微生物鞭毛、纤毛和菌毛运动性降低，于附着物表面形成微菌落。(4)定植或成熟：成熟生物膜形成特征性蘑菇状或郁金香型三维立体结构，并可见EPS包被的非运动性微生物以及营养物、水通道。(5)播散：微生物生长过程中产生的酶、外部环境的影响以及人体内相互作用都可能导致生物膜中微生物细胞的播散[6]。

2　生物膜与相关感染

近些年，随着医疗技术的不断发展，导尿管、中心静脉导管、人工心脏瓣膜、支架等侵入性医疗器械得到广泛应用。微生物易附着于医疗器械表面形成生物膜，医用生物材料相关生物膜感染率因此逐年上升。多项研究发现黏液性铜绿假单胞菌最易发生黏附形成生物膜，其他生物医学材料相关感染细菌主要涉及肠球菌、链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等[7-8]。此外，真菌如白念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、荚膜组织胞浆菌等均能形成生物膜。

人体中，生物膜好发于小肠刷状缘(霍乱弧菌)、尿道黏膜(淋病奈瑟菌)、肠淋巴结(鼠伤寒沙门菌)、抗菌药物顽固性粉刺、慢性感染的扁桃体等部位[9]。牙菌斑就是由多种微生物组成的口腔生物膜结构，牙周炎则是口腔生物膜中微生物之间相互作用的典型例子。临床上一些急性感染通常可被抗生素有效治疗，而慢性感染往往涉及生物膜，不易治愈，易于复发，如慢性呼吸道感染、慢性中耳炎、肺囊性纤维化、慢性前列腺炎、慢性鼻窦炎等。多数感染性心内膜炎患者心脏瓣膜受损，主要致病菌(链球菌、肠球菌和葡萄球菌)更容易黏附定植形成生物膜[10]。此外，生物膜可刺激机体产生抗体，但抗体不能有效杀死生物膜内微生物，反而形成免疫复合物破坏周围组织，从而引起变态反应性疾病。

3　生物膜与微生物耐药性

传统观点通常认为，微生物的耐药由灭活酶与钝化酶的产生、抗菌药物渗透屏障和主动外排泵作用、药物作用靶位结构改变等因素所导致[11]，但是生物膜的形成也是一个重要的原因。生物膜的形成可使抗菌药物耐药性提高10～1 000倍[12]，即使不携带耐药基因的微生物一旦形成生物膜，抗菌药物的敏感性也会大幅度降低，当生物膜被破坏后，其抗菌药物敏感性又可恢复。生物膜对抗菌药物敏感性降低被认为是一系列机制共同作用的结果。生物膜造成耐药的机制主要包括以下几种。

3.1抗菌药物渗透缓慢或不完全抗菌药物在糖蛋白或多糖中的扩散速度为在纯水中的36%～76%，这会导致抗菌药物在生物膜中的杀菌能力降低，同时抗菌药物的物理流动并不能确保所有的抗菌药物100%渗透进生物膜[11]。一项研究表明，生物膜EPS携带负电荷，而氨基糖苷类抗菌药物携带正电荷[11]，这可能也是抗生素渗透障碍的原因。但是有体外实验研究发现，大多数情况下抗菌药物在渗透进入生物膜时并未大量被中和或吸附，还是可以很快渗透到部分微生物生物膜内部，如喹诺酮类、四环素、万古霉素等[13-15]，只有β-内酰胺类和氨基糖苷类抗菌药物明显被生物膜限制，存在严重渗透障碍。由此可见，渗透障碍并非造成微生物耐药的主要原因。

3.2微环境改变与缓慢生长抗菌药物(例如青霉素)杀菌作用往往是生长依赖的，只对生长期的微生物具有杀菌作用[11]。研究人员通过荧光探针和报告基因技术对生物膜中微生物生长模式与代谢活性情况进行分析，发现生物膜中代谢产物浓度、营养成分由外到内呈梯度分布。此外，氧气浓度和pH值等也会共同作用使生物膜微环境发生特殊改变。在这种特殊微环境下，微生物长期处于饥饿状态，生长缓慢或处于静止状态，对抗菌药物的敏感性低于对数生长期的微生物，当停止使用抗菌药物治疗后，存留微生物利用死亡微生物为营养进行繁殖，重新形成生物膜，致使感染反复发作，最后往往演变成慢性感染[11,16]。

3.3基因诱导生物膜表型改变一些独特基因会参与改变微生物的代谢途径，诱导表达特异性生物膜表型，从而起到保护生物膜作用。例如，Muca基因的突变会导致铜绿假单胞菌EPS藻酸盐的大量产生，使其生物膜比野生型要厚，并从非黏液表型向黏液表型转变，形成具有保护性的生物表型，从而导致耐药[17]。此外，rpoS基因突变的铜绿假单胞菌其生物膜要比野生型更厚，并使其对妥布霉素的敏感性降低[11]；gacA基因能促进生物膜成熟，其突变会使抗菌药物杀菌作用增强[11]。

3.4应激反应的激活微生物可以进行大量的应激反应来适应环境的波动(例如温度变化、氧化应激、低水分活性、DNA损伤、饥饿状态等)，属于一种保护性反应。应激反应下的生物膜微生物在分子和遗传特征方面有别于浮游微生物[11]。σ因子RpoS是一种应激反应调控因子，已经在铜绿假单胞菌生物膜中检测到，rpoS基因转录物也被发现于囊性纤维化患者的痰液中，这表明生物膜内低营养物质、代谢产物堆积等造成的微环境的改变激活了σ因子RpoS的表达，胁迫微生物发生适应性反应来抵抗环境压力以及抗菌药物的作用[18]；但是rpoS基因突变体形成的生物膜抗菌药物敏感性研究不支持该基因保护生物膜的作用[19]，所以其在生物膜耐药性中的作用还有待研究。

3.5外排泵系统生物膜中多种药物外排泵的组成型表达也可能是造成耐药的原因；研究人员利用DNA微阵列等方法，发现铜绿假单胞菌和白色念珠菌生物膜中外排泵基因的表达高于浮游微生物[19]，由此可见生物膜加强了抗微生物药物外排泵的合成，导致生物膜微生物耐药性的出现。

3.6抗菌药物水解酶Elkins等[11]研究发现铜绿假单胞菌生物膜能够激活诱导型过氧化氢酶基因katB。Strathmann等[20]研究发现,细菌生物膜形成后β-内酰胺酶的活性显著增加，青霉素和头孢类抗菌药物的抗菌效果明显下降，由此可见生物膜会加强部分抗菌药物水解酶的表达。

3.7持留菌虽然抗菌药物和化学消毒剂等能杀死大部分生物膜(包括双层生物膜)内的微生物，但仍会有少部分存活，这些存留微生物受到高度保护，对抗菌药物表现出高耐药性，即使延长抗菌药物治疗也不受影响[11]。Lewis等[21]研究发现持留状态下的大肠埃希菌高表达hip基因，因此一些编码调节回路的基因被认为有助于微生物转变为持留状态，并发生一些特殊的保护性反应，从而造成生物膜对抗菌药物敏感性的降低。

3.8QS系统QS系统是微生物间通过分泌、释放一些特定的信号分子，以“集体作战”方式来应对生存环境变化的群体行为，可发生于种间或种内。当生物膜内微生物数量过多时，QS会使部分微生物从生物膜表面脱离，导致感染扩散或复发，引起临床症状。另外有研究表明QS调节在红霉素耐药性增加中起重要作用[16]。

4　生物膜实验室检测

4.1染色法

4.1.1结晶紫染色法培养物生物膜经过结晶紫染色、冲洗、脱色后用紫外分光光度计测定590 nm处的吸光度[22]。该法可同时对生物膜进行定性和定量检测，操作简单，且可在普通实验室开展。

4.1.2阿利新蓝-刚果红染色法微生物细胞外多糖被阿利新蓝-刚果红复合染液染成深红色，生物膜为黄色，背景为淡蓝色，以此来检测生物膜形成情况[23]。另外，刚果红培养基(0.8 g/L，脑心浸液干粉37 g/L，蔗糖50 g/L，琼脂12 g/L)法也被用来检测生物膜，研究人员将微生物接种于刚果红培养基，37 ℃培养，若出现褐红色、干燥菌落则为生物膜阳性[24]。但有研究发现该方法不适用于检测葡萄球菌生物膜。

4.1.3快速银染法快速银染法主要利用阴离子被还原成金属银而使生物膜中的多糖蛋白复合物染成灰褐色或灰黑色，以此来观察不同阶段生物膜中多糖蛋白复合物的动态变化情况。该方法操作方便，敏感性较好，试剂价格低廉，普通的微生物实验室就可进行操作。该染色法只能用于初步观察生物膜的形成，无法检测其黏附能力、空间分布等。

4.2显微镜检测法扫描电子显微镜、透射电子显微镜、普通光学显微镜、荧光显微镜等都被用来研究生物膜，但其中大多数微观方法都涉及样本的制备(包括染色、固定、冷冻、脱水、包埋、切片)，但是生物膜很柔软且水分含量很高，制片时细胞膜容易发生收缩并变形，从而引起生物膜结构和组成成分的改变，使观察结果与实际情况存在差异[5]。激光扫描聚焦显微镜是目前研究生物膜较理想的方法，其无需进行样本制备，可以较好地保持生物膜结构的完整性，同时可结合二乙酸和钙黄绿素等荧光染料观察生物膜中的各种成分、三维结构及动态变化过程[25]。原子力显微镜由于其分辨率高(达纳米级)，样品制备简单，在近年来也被较多地用于研究生物膜动态形成过程中的表面变化。

4.3荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术FISH是较新发展的用于生物膜微生物群落量化分析以及确定微生物种群空间分布情况的技术。FISH不需提取核酸，可直接利用荧光寡核苷酸探针标记进行原位杂交，探针可以用不同荧光染料标记，每种荧光剂都有不同的激发谱和发射谱，因此，可同时使用两种或两种以上(最多可达7种)探针检测不同种群。FISH灵敏度高、检测快速，但荧光弱易导致假阴性，并且只能确定微生物种群空间分布情况，无法判断其是否具有活性[5]。

4.4PCR基因检测技术随着分子生物学技术的发展，基因PCR检测成为一种免培养、快速有效诊断生物膜阳性率的技术。生物膜形成相关的基因有rpoS(铜绿假单胞菌)、mbaA(霍乱弧菌)、icaABCD(葡萄球菌)等[26-28]。

4.5报告基因报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用其表达产物来标定目的基因的表达调控，所以利用转入生物膜中的荧光蛋白自身发光即可实时动态观察生物膜及其空间分布情况。常用的报告基因有萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶以及荧光蛋白家族的绿荧光蛋白。

5　生物膜的防治

5.1物理方法对于已形成的生物膜可采取机械、超声波、电击等方法清除。

5.2噬菌体噬菌体在环境中无处不在，大部分噬菌体具有溶胞作用、宿主特异性，并且对人类无毒，由于其必须穿透宿主EPS进行复制，所以在一定程度上可以控制生物膜的形成[6]。

5.3QS酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones, AHLs)是调控QS系统的关键信号分子，一些细菌、真菌和植物可分泌抗QS分子(如AHL内酯酶)从而抑制或降低QS，影响生物膜的形成。AHL内酯酶广泛存在于微生物中，具有较好的应用前景，但其作用机制尚未完全清楚，目前相关研究和报道也较少[6]。

5.4EPS崩解部分微生物分泌的抗黏附多糖或蛋白质可以减少生物膜的产生，如多糖解聚酶、酯酶和Dispersin B等促解离剂能破坏已形成的生物膜，使消毒剂可以更好地作用于生物膜内的微生物[6]。

5.5光敏剂光敏作用是涉及光敏剂、光以及氧气的非热处理方法。Luksiene等[29]研究表明光敏作用可以杀死食源性病原菌生物膜。

5.6抗生物膜活性生物化合物许多植物和微生物尤其是海洋细菌能分泌抗生物膜化合物，如蔗糖脂肪酸、萘环衍生物等均可减少体外生物膜的形成[30-31]。Jiang等[32]最新研究显示，海洋弧菌对铜绿假单胞菌具有抗生物膜活性，但对金黄色葡萄球菌无效。Sayem等[33]发现从地衣芽胞杆菌分离出的EPS对大肠埃希菌和荧光假单胞菌具有抗生物膜活性。Dheilly等[34]报道交替假单胞菌属培养上清液对肠道沙门菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌具有抗生物膜活性。

5.7金属离子银离子、铜离子、钙离子等都被证明对生物膜的形成有一定的抑制作用。

5.8新型抗菌生物材料微生物黏附是生物膜形成的第一步，所以改变生物材料理化性质或在生物材料表面涂抹具有抗菌生物活性和抑制微生物黏附的物质(如银)，可有效减少生物膜的形成。

5.9药物防治两性霉素B对念珠菌生物膜具有独特药效，棘白菌素类药物也可显著抑制白念珠菌生物膜的形成[35]。体外研究表明，部分大环内酯类抗生素能进入生物膜内层，具有抗生物膜作用；大蒜素可抑制EPS的合成，从而抑制生物膜的形成。抗生素联合使用对生物膜有显著抑制作用，如罗红霉素和氟罗沙星合用，罗红霉素通过抑制细菌多糖蛋白复合物合成来增强氟罗沙星对生物膜的渗透。所以，新型生物膜特异性抗生素的研发有利于控制生物膜感染。此外，新型药物传输系统如脂质体、类脂质体、聚合物粒子以及树状聚合物等均可提高抗菌药物在生物膜中的透过性，从而提高药效[1]。

6　结语

生物膜特殊结构所致的独特耐药性使得生物膜相关性感染成为慢性、难治性疾病。现在许多抗菌药物被用来对抗微生物生物膜，但抗菌药物的不合理治疗也可能导致低效的生物膜控制以及耐药性的传播。随着对生物膜耐药机制、检测方法、防控手段等研究的不断深入，以及对抗生物膜新型药物的研发，相信在不久的将来，生物膜相关感染可以得到有效的控制。

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(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.01

林迪，1987年生，女，大学本科，技师，从事临床微生物学检验。

孙长贵，主任技师，教授，硕士研究生导师，E-mail: suncgui@163.com。

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2017-01-09)