考马斯亮蓝G—250染色法测定苜蓿中可溶性蛋白含量

焦洁

摘要：蛋白质的存在，会影响到酸碱测定中所用的某些指示剂的颜色变化，从而会改变染料的光吸收。因此在此基础上发展了蛋白质的染色测定方法，所涉及的指示剂目前最为广泛使用的染料就是考马斯亮蓝。该文分析了考马斯亮蓝G-250染色法，测定苜蓿中的可溶性蛋白含量。

关键词：考马斯亮蓝；苜蓿；蛋白含量

可溶性蛋白是属于蛋白质的一种，由于生物体内主要吸收利用的是可溶性蛋白，即可溶性蛋白含量高的植物开发价值高。苜蓿是一种叶蛋白含量较高的植物，但是，其中可溶性蛋白与总蛋白含量不一定成正比例关系。目前也没有相关苜蓿中可溶性蛋白含量的报道，因此我们在苜蓿叶蛋白含量测定基础上对其可溶性蛋白进行了测定。通过对蛋白质含量分析、了解为苜蓿资源评价提供参考依据。鉴于一般植物体内可溶性蛋白含量较低的特点，我们采用具有消耗蛋白质量小、灵敏度高、受外界因素影响小等特点的考马斯亮蓝G-250染色法（CBB）来测定[1，2]。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。染料的最大吸收从465 nm变为595 nm，蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1 ug蛋白质。染料与蛋白质的结合，大约只需2 min，结合物的颜色在1 h内是稳定的（测定须在1 h内完成）。一定范围内，溶液在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。本法试剂配制简单，操作简便快捷，灵敏度高，测定范围1-1000 ug 。

1 仪器、材料及试剂

Cary50紫外分光光度计；牛血清蛋白进口分装；考马斯亮蓝G-250进口分装（上海新型化工试剂研究所）；其他药品试剂均为国产分析纯。新鲜苜蓿

2 标准溶液及样品浸体液制备

蛋白质标准溶液的制备：称取牛血清蛋白25 mg，加水溶解并定容至100 mL（250 μg/mL），再吸取上述溶液40 mL，用蒸馏水稀释至100 mL即可（100 μg/mL），所配置标准储备液须在冰箱中保存。

考马斯亮蓝G-250溶液制备：准确称取100.00 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL90%乙醇中，再加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1000 mL。此溶液在常温下可放置一个月。

样品浸体液制备 ：称取苜蓿干样0.07 g（其他植物样品按蛋白质含量而定大约干样0.05-0.07 g，新鲜样0.5 g左右），加少量石英砂用蒸馏水研磨成匀浆定容至100 mL，静置10-30 min（期间摇动数次）过滤（含色素可用活性炭脱色），过滤定容至10 mL。

3 检测结果及讨论

3.1 标准曲线绘制

取6支试管，按表1，数据配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1.0 mL。准确吸取所配各管溶液0.1 mL，分别放入10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色，所测数据以蛋白含量（X）为横坐标以吸光度（A）为纵坐标进行线性回归分析，回归方程为：A=1.13265×C=4.3743，R=0.9927。

3.2 重现性试验

准确称取同一种样品5份（1号样），按“样品浸体液制备”和“标准曲线绘制”项下操作，测定吸光度，RSD%=1.6，具体测定值如表2。

3.3 加标回收率试验

准确称取一支含量的样品（2号样），分别加入一定量的牛血清蛋白，按"样品浸提液制备"和“标准曲线绘制”项下操作，测定吸光度，平均回收率为97%，RSD%=3.7。具体结果见表3。

3.4 前处理方法改进试验

我们根据实验室仪器设备以及样品条件在浸提方法上与传统提取方法进行对比改进，进行了一定的改进，使得浸提样品方便快捷，并能达到浸提完全。 具体处理方法及数据见表4。

由表4结果可见，方法②、③前处理效果比④、⑤、⑥方案浸提更完全，测定样品可溶性蛋白浓度值根接近经典方法，而与①比较方法②是样品浸提方案中最简便、快捷、测定準确的前处理方案。

3.5 显色稳定性试验

准确称取（1号）样品0.7 g，按“样品浸提夜制备”及“标准曲线绘制”项下操作，每隔一定的时间测定一次吸收度，结果表明，再显色3 h内吸收无变化。

4 讨论

本研究通过考马斯亮蓝G-250染色法对苜蓿中较低浓度的可溶性蛋白含量进行测定以了解苜蓿中可溶性蛋白含量的情况，并进行处理方法筛选，确定测定低浓度蛋白质的最佳条件。结果表明：

考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，在一定蛋白质浓度范围内（1-1000 μg）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合物在595 nm波长下的吸光度于蛋白质含量成正比符合朗贝比尔定律，故可用于蛋白质含量的测定。

CBB染色法是定量测定低浓度蛋白质溶液的快速、灵敏的方法，但在应用中我们发现CBB染色法测定的吸收度值与蛋白质浓度的线性关系明显，但平行测定的相同浓度的吸收度变化较大，影响测定结果的准确性。

为了验证考马斯亮蓝G-250染色法的准确性，我们进行了重复性试验对每个样品测定3次，求得样品的平均值，其可溶性蛋白18.45-14.42 g/kg的范围，由RSD=1.6%可知结果是较稳定的，该方法对苜蓿中可溶性蛋白测定结果较准确。

参考文献

[1] 王爱军，王凤山，王友联，等. 低浓度蛋白质含量测定方法的比较[J]. 中国生化药物杂志，2003.24（2）：78-80.

[2] 王卫国，吴强，胡宝坤，等. 几种测定灰树花多糖中蛋白质含量方法的比较研究[J]. 2003，22（1）：27-30.

[3] 李建武，余瑞元，等. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京：北京大学出版社，1994.160-176.