血管生成素4的研究进展

林梦雨，尹雁斌，陈 韬

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

专论与综述

血管生成素4的研究进展

林梦雨，尹雁斌，陈 韬※

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

断奶仔猪的腹泻是养猪业一直以来的难题，ANG4(Angiogenin 4，血管生成素 4)是一种由肠道细胞分泌多肽类蛋白，具有抗菌、减缓炎症发生、促血管生成及维持肠道粘膜屏障完整的作用，在防治仔猪断奶方面具有广阔的前景。文章对 ANG4的发现、表达以及作用机制等方面的研究进展进行综述。

血管生成素 4；血管生成作用；抗菌肽；肠道炎症

1 ANG 家族的发现

上个世纪 70 年代，Folkman 等发现微血管构成是实体肿瘤形成、发展和迁移过程中极为重要的步骤，还证实了肿瘤细胞能分泌一种生物因子刺激肿瘤内新的血管网络产生，并将这种生物因子命名为血管生成素(Angiogenin,ANG)。1985 年，这种调节因子首次在人类的结肠癌细胞系 HT-29 细胞培养上清中被发现[1]。

ANG 含有 123 个氨基酸残基，是一种分泌性单链蛋白，相对分子质量约为 14kD，ANG 与胰核糖核酸酶的氨基酸序列有 35%的一致性，晶体结构也极为相似[2]。ANG 属于核糖核酸酶超家族(RNase, ribonuclease A family)， 具 有较 低 的核 糖 核 酸酶活性，而且与其他 RNase 超家族基因一样均定位于14 号染色体上[3]，ANG 是目前已知所有血管生成因子中唯一具备核糖核酸酶活性的调节因子，也是核糖核酸酶超家族中唯一具备促血管生成能力的成员。

此后对 ANG 的进行的一系列研究发现 ANG是一系列分泌型的生长因子，目前鼠源ANG家族主要由 angiogenin-relatedprotein（mANGRP,renamed mANG2）、mANG3、mANG4、mANG5 和 mANG6 五种类型组成[4]，该家族成员广泛存在于生物机体多种组织中，表明了 ANG家族成员不仅具有促血管生成作用，可能还具有其他生理功能。其中本文研究的 ANG4是一种在动物肠道内主要由杯状细胞和潘氏细胞分泌的蛋白，ANG4 含有 144 个氨基酸残基，相对分子质量约为 16 kD，其基因与其他家族成员一样，也定位于 14 号染色体[3]。

2 ANG4 的生理功能

ANG在血管形成和肿瘤发展过程中的重要作用早已被发现，但很多研究表明ANG除血管生成作用以外还具有更多的生理功能，其家族成员中的ANG4不仅在体外不仅表现出一定的促血管生成能力，还能促进黑色素瘤细胞的增值，但无法促进内皮细胞与成纤维细胞的增值和迁移[4]，另外还有很多研究发现 ANG4的表达与炎症的发生密切相关，所以 ANG4异常表达可能对肠道炎症的发生具有重要指示意义，其家族成员中的 hANG(人源的血管生成素)、mANG1(鼠源血管生成素 1)都具有一定的抗菌作用[5]。这也是本文探讨的重点，一种可能替代抗生素杀灭细菌的新型抗菌肽。

研究表明 ANG4在小鼠小肠内的潘氏细胞、结肠的杯状细胞和胰腺中均有表达，且在潘氏细胞中表达受到肠道微生物群的影响，另外 ANG4 不仅参与了肠道血管的生成过程，还表现出能选择性杀死一些肠道病原微生物的特性，这表明了 ANG4在肠道的先天性免疫体系中扮演了重要的角色。ANG4对粪肠球菌和李斯特氏菌（两种都是革兰氏阳性菌）具有强力的杀菌效果，对多形拟杆菌（肠道中的一种常见细菌）则不敏感，此外 K12 大肠杆菌和非致病性李斯特氏菌则对 ANG4 有明显的抵抗力[5]。这表明ANG4能选择性的杀死有害的病原微生物。

另外与 ANG4 同属于 RNaseA 超家族的某些其他成员也表现出与之相类似的杀菌功能，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（Eosinophil cationic protein,ECP, RNase3）对金黄葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌具有中等杀菌活性，ECP 除了杀菌活性以外还具有其他抗病原体活性，包括杀虫活性和对真核细胞的毒性[6]。 RNase7 和 RNase8 都 具 有 很 强 的 广 谱 杀 菌 活性，即使在很低的微摩尔浓度下也能抑制甚至杀死例如金黄色酿脓葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、屎肠球菌和绿 浓杆菌等细菌[7,8]。另外人 ANG 和小鼠ANG1 也都具有微弱的杀菌活性，从家鸡中分离出来的 RNaseA-2 以及从斑马鱼中克隆表达的三种核糖核酸酶重组蛋白 （DrRNase1,DrRNase2,Dr-RNase3）都具有较为明显的杀菌活性[9]。虽然这些成员的杀菌机制各有差异，但是却在某一些机制上有类似之处甚至是共同之处。

有研究发现在小鼠感染了鼠鞭毛虫后，小鼠肠道内的潘氏细胞和杯状细胞会大量分泌 ANG4，在此过程中，调节 ANG4表达的关键因素是多种白细胞介素的分泌刺激，其中最为关键的是 IL-13 和IL-25，这两种白细胞介素都是强力的抗炎因子，能有效的抑制炎症发生，而且还具有修复肠道损伤的功能[10,11]。但是 IL-13 和 IL-25 诱导 ANG4 的过程中又涉及到多种 Toll受体（Toll like recepto,TLR）介导的信号传导通路[11]，而 TLR 介导的信号通路通常是促使炎症的发生以激活宿主的免疫防御[12]。因此ANG4和上文提到的人 ANG一样，在调节炎症反应的发展中起到作用可能与炎症发生的状态密切相关，但是毋庸置疑的是 ANG4在调节炎症反应的过程中起到了极为重要的作用，并且可能还具有维持肠道完整性的功能。

3 ANG4 的表达调控

Hooper LV 等[5]利用 qRT-PCR 技术对小鼠内ANG的 mRNA进行辨别，在小鼠的小肠内发现了ANG4 mRNA，此后还利用了激光捕获显微切割技术对小肠内的潘氏细胞、小肠上皮细胞和间质细胞进行了分析，发现了在小鼠小肠内，潘氏细胞和杯状细胞是ANG4主要的表达场所。

另外 Hooper LV 等[5]以不同方式喂养生理状相同的无菌小鼠后，发现了 ANG4的表达极有可能受到肠道微生物群的影响。当以无菌方式喂养无菌小鼠时，其体内几乎检测不到 ANG4 的表达，而以无菌方式喂养只定植了多形拟杆菌的无菌小鼠，发现其体内ANG4的表达远低于正常饲养的正常小鼠，当以常规方式喂养无菌小鼠时，其体内 ANG4 的表达量与正常小鼠无异[5]。

另外ANG4的表达还受到病原菌产物的影响，尤其是某些革兰氏阴性细菌的脂多糖(Lipopolyoaccharide,LPS)成分会上调 ANG4 的表达。用 LPS 处理从小鼠体内分离出的肠道腺窝，结果显示细菌的脂多糖能明显刺激小肠隐窝中 ANG4和溶酶菌的分泌，其作用机制可能与 TLR4 信号转导通路有关[5]。TLR 分布在机体内绝大多数组织内，它们能特异性识别某些病原微生物和其产物具有的特殊结构，能过对不同病原微生物进行辨别并发生特异性结合，产生一些特殊信号从而诱导炎症反应的发生，在先天性免疫防御中起到极为关键的作用[12]，其中 TLR4 是介导内毒素 /脂多糖应答的最主要受体，TLR4 信号转导通路也是目前发现最重要的炎性通路之一[13]。这一系列实验表明了 ANG4 的表达受到了肠道微生物群的影响，也从侧面表明 ANG4也参与了肠道的免疫反应。

ANG4最早在小肠的潘氏细胞中发现有表达，此后的研究也发现在大肠中也有 ANG4的踪迹，并有相关的研究发现在缺乏潘氏细胞的大肠内，杯状细胞是ANG4主要的表达场所。另外有研究发现在断奶 14天的小鼠体内 ANG4的表达量明显低于断奶 28 天的 小鼠[14]，这可能 与潘氏细 胞 在 小鼠体 内的发育过程有关，小鼠体内的潘氏细胞通常在其出生后的三到四周时发育完全[15]，而潘氏细胞又是ANG4的主要表达场所之一。

此外还发现了 ANG4的表达受到某些白细胞介素的影响，ANG4 在肠道内的表达受到 TLR4、IL-13 和 IL-4 等因素的影响，其中 IL-13 的参与是ANG4 表达上调必不可少的因素[16]。在皮肤组织产生抗菌肽以及肠道发生炎症激活T淋巴细胞时，IL-22 与 IL-17 的参与是必不可少的前提条件[9]，而当肠道发生炎症时 ANG4 的表达量会明显上升[17]。此外 Zannatun Noor 等人进行的一系列研究发现在IL-25 调节 ANG4 的表达的过程中，IL-13 起到了至关重要的作用。

IL-25 也是一种 Th2 型细胞分泌的细胞因子，并且能诱导非 T细胞、非B细胞及造血干细胞的分化，从而启动免疫反应，进而驱除肠道寄生虫[10]。小鼠感染旋毛虫后，在驱除蠕虫的同时，IL-25 不仅发挥着保护机体的作用，还促使了 ANG4的表达上调[18]。IL-25 促使 ANG4 表达量增加的机制不仅在驱除肠道寄生虫时发挥着重要作用，在肠道发生炎症时也起到了重要的作用。IL-25 能特异性的诱导嗜酸性粒细胞的侵润并激活 Th2 细胞的应答，上调IL-4、IL-5、IL-13 等细胞因子的表达水平，而这些细胞因子都是强力的抗炎因子[19]。其中 IL-25 诱导IL-13 表达水平上调的机制对 ANG4 的表达起到了至关重要的作用。

IL-13 是由 Th2 型细胞分泌的细胞因子，研究表 明 IL-13 能 全 面 抑 制 促 炎 症 细 胞 因 子 IL-1、IL-8、IL-12 等合成，能促进抗炎症细胞因子 IL-1ra的产生。IL-13 还能通过影响肠道上皮细胞的凋亡，紧密连接以及肠道修复功能，从而缓解肠道炎症引起的肠道屏障的损伤[20]。而 IL-13 能诱导 ANG4 的表达，也从侧面说明 ANG4可能在肠道炎症起到抑制炎症发生及维持肠道屏障完整的作用。

Zannatun Noor 等[18]进 行 的 一 系 列 实 验 也 表明IL-25、IL-13 在 ANG4 表达过程中起到了关键作用，Zannatun Noor 等人用不同的试剂处理了生理状态相近的实验小鼠，其中对照组用 PBS 处理，实验组用重组 IL-25 每天腹腔注射 0.5 g 处理 10 天。最后发现实验组体内的 ANG4的表达量超过了对照组 100 多倍。由此可以推测 IL-25 与 IL-13 是调控ANG4 表达的重要因子。从这些研究可以发现ANG4作为一种由肠道上皮细胞分泌的抗菌肽，在维持肠道稳态的过程中发挥着重要重作用。

4 小结

ANG家族蛋白作为一类新型抗菌肽，它不仅能选择性的杀死致病菌而不损害有益的共生菌，并且对于肠道菌群容易受到环境影响而发生紊乱的断奶仔猪而言，ANG 家族蛋白能够维持肠道微环境的菌群稳定。另外在肠道炎症发生时ANG4与多种白细胞介素的相互作用预示着 ANG4在炎症发生时也起着重要作用。虽然目前对ANG4的研究已取得一些成果，但对其生物作用仍存在一些争议，另外对 ANG4具体的表达机制以及抗菌机理也有待研究，ANG4是否还有其他作用也不能确定。不过就目前 ANG4表现的出的血管生成作用、抗菌作用及在肠道炎症发生时的重要作用，可以预知ANG4在畜牧养殖这一方面具有广阔的应用前景。

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S851;R457

A

1006-4907（2017）03-0043-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.03.019

2017-06-06

林梦雨（1996～），女，汉族，本科生，linmenyu96@163.com。

※通迅作者:陈 韬（1969～），男，教授，博士，主要从事动物肠道粘膜免疫分子生物学研究，chentao_114@163.com。