二甲双胍抑制耐药卵巢癌细胞生长的实验研究

李丹丹 魏雨田 陈 燕

华北理工大学附属医院 河北唐山 063000

二甲双胍抑制耐药卵巢癌细胞生长的实验研究

李丹丹 魏雨田 陈 燕

华北理工大学附属医院 河北唐山 063000

①目的 研究二甲双胍是否对耐药卵巢癌细胞的生长有抑制作用。②方法MTT法检测不同浓度二甲双胍(0、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L)作用48小时后对卵巢癌SKOV3/DDP细胞生存率的影响。③结果 二甲双胍对于SKOV3/DDP细胞具有剂量依赖的抑制作用(P<0.05)，最大抑制率为72%。④结论 二甲双胍不仅能够抑制卵巢癌SKOV3/DDP细胞增殖而且随着浓度的增高抑制性增强。

二甲双胍 卵巢癌 增殖

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，而且其病死率位居首位，成为妇科恶性肿瘤致死的主要原因。我国卵巢癌的发病率及病死率呈逐年上升趋势[1]。目前临床上的主要治疗方案是肿瘤细胞减灭术联合以紫杉醇、铂类为主的化疗。但是现有的研究表明，化疗不良反应较大，而且化疗价格昂贵以及原发性与获得性耐药等原因，导致5年生存率仍然很低。所以，越来越多的科研工作者对于发现新型化疗药物、提高现有化疗药物的敏感性或者逆转化疗耐药投以高度的关注。二甲双胍是目前临床上广泛应用的治疗糖尿病的药物，主要作用机制为抑制肝糖元分解，也能够改善外周组织对胰岛素的敏感性、增加葡萄糖的摄取和利用。同时促进脂肪和肌肉组织对葡萄糖的摄取，从而达到降低血糖的作用。最近研究发现二甲双胍不仅是一种非常好的治疗糖尿病药物，还具有多重抗肿瘤效应[2]，它可有效抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡及细胞周期停滞，能够抑制肝癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和肾癌等肿瘤的生长[3～5]。但其抗肿瘤作用机制错综复杂，仍需要进一步研究[6,7]。二甲双胍能够抑制人肿瘤细胞生长，但是对卵巢癌的抑制作用及机制尚不明确。因此，本研究将探讨二甲双胍对卵巢癌SKOV3/DDP细胞增殖的影响，为卵巢癌的临床预防及治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞(北京协和细胞库)；二甲双胍(sigma公司)、MTT(Sigma公司)；1640培养基(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、胰酶(Biological Industries)。

1.2 实验方法

1.2.1 卵巢癌细胞的培养 卵巢癌SKOV3/DDP细胞株是通过长期小剂量顺铂刺激SKOV3培养出的具有耐药性的卵巢癌细胞株。将耐药细胞株SKOV3/DDP接种于15%磷酸盐缓冲液(FBS)的1640培养基中、置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。将亲本细胞SKOV3接种于10%FBS的DMEM培养基中培养。在倒置相差显微镜下观察细胞，待细胞铺满80%时，弃掉培养基，用胰酶消化后在显微镜下观察，当细胞回缩为圆形时，加入培养基终止消化。轻轻吹打细胞，当贴壁细胞悬浮，无细胞团，将细胞放入新的培养瓶中，加入培养基，置于细胞培养箱中继续培养。

1.2.2 MTT法检测二甲双胍对卵巢癌细胞的增殖抑制率 取长满培养瓶80%的对数生长期的SKOV3和SKOV3/DDP 细胞，去掉培养基，用PBS冲洗两遍，再用胰酶消化2～3分钟，然后加入完全培养基终止消化，用枪头轻轻吹打细胞至无细胞团，然后用移液管，将混匀的细胞悬液吸至50mL离心管中，上离心机，1500r/min离心5min，丢弃上清，然后加入培养基5mL稀释，用细胞计数板计数，进而根据细胞密度，再加入适量培养基，最终稀释成1×104/mL，并将其加入96孔板中，每孔加入200μL，细胞培养箱中过夜，当细胞贴壁后，弃掉原有培养基，用PBS冲洗2遍，然后再加入二甲双胍浓度梯度为0、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L的复合培养基，重复5次，培养48小时，到规定时间后，从温箱中拿出96孔板，吸净原有培养基，继而每孔加入噻唑蓝20μL，在温箱中继续培养4个小时，再次吸净，每孔再加入二甲亚砜(DMSO)10μL，震荡混匀，使结晶物充分溶解，选择波长为490nm，在酶联免疫吸附仪上测定各孔OD值。测定细胞增殖抑制率=(1-实验组光度吸收值OD值/对照组光度吸收值OD值)×100%。比较不同浓度二甲双胍对亲本细胞SKOV3和耐药细胞SKOV3/DDP增殖抑制作用。

2 结果

2.1 卵巢癌SKOV3/DDP细胞的形态学观察 在倒置相差显微镜下观察细胞形态,二甲双胍作用48小时后，对照组SKOV3/DDP细胞生长良好，多为梭形，贴壁生长，细胞形态饱满，经不同浓度二甲双胍干预后，存活细胞数目减少，细胞形态改变，收缩变小，细胞体内颗粒感增强，透光性差，细胞与细胞间边界不清楚。随着二甲双胍浓度的增加，上述现象更加明显，见图1。

注：A:对照组(4×);B:对照组(10×);C:10mmol/L的二甲双胍(10×)；D:80mmol/L的二甲双胍(10×)

图1 二甲双胍干预48小时各组与对照组细胞形态的比较。

2.2 二甲双胍可抑制卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP的增殖MTT实验检测结果显示，二甲双胍的浓度越高，对卵巢癌亲本细胞SKOV3和耐药细胞SKOV3/DDP的增殖抑制率越高，提示在体外研究中，二甲双胍可以抑制卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP的增殖活性。当作用时间固定为48小时，不同浓度的二甲双胍组的增殖抑制率与对照组比较有差异(P<0.05)。提示增殖抑制率具有浓度依赖性，最大抑制率为72%。而相同浓度二甲双胍对卵巢癌亲本细胞和耐药细胞增殖抑制率的影响无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 不同浓度二甲双胍对卵巢癌细胞的增殖抑制率±s)

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，是病死率最高的妇科恶性肿瘤之一，对妇女的生命和身体健康造成了严重威胁。卵巢位于盆腔深部，所以卵巢癌起病隐秘，早期的症状和体征不明显，就诊时绝大部分已经是晚期，多有盆腹腔转移，患者预后不好。现在卵巢癌首选的治疗方案是肿瘤细胞减灭术联合以铂类和紫杉醇类为主的术后辅助化疗。尽管有大约70%～80%卵巢癌患者对铂类为主的初始化疗有效，然而耐药率特别高，5年生存率不到1/3。所以寻找新型化疗药成为非常有意义和亟待解决的问题。

二甲双胍单独应用很少引起低血糖，并且，二甲双胍被认为有助于延缓或改善糖尿病血管并发症，这种改善作用不仅体现在其能降低血糖，而且能够调节脂质代谢、内分泌功能、高凝状态和血小板机能亢进，这些调节功能跟肿瘤的发生、发展也密切相关。二甲双胍的抗肿瘤作用最初是通过观察性研究调查发现的。通过收集大量的临床病例，经过严密的统计学分析发现糖尿病患者发生肿瘤的概率高于非糖尿病患者，而临床上应用二甲双胍来降低血糖的患者的肿瘤发生率明显减小。Libby等[8]通过对8 000例糖尿病患者的观察分析发现，有大概半数的患者接受二甲双胍治疗，另外约1/2的患者接受其他药物治疗，最终发现应用二甲双胍的患者恶性肿瘤发生率为7.3%，而使用其他药物的患者恶性肿瘤发生率为11.6%，随访时间中位数分别为 3.5年及2.6年(P<0.01)。与此同时，口服二甲双胍治疗的患者总的肿瘤相关病死率为3.0%，而应用其他治疗的患者总的肿瘤相关病死率为6.1%，明显比前者高。从而得出结论，二甲双胍提高了肿瘤患者的生存率。最近在动物及实验室细胞研究上取得一些进展，让人们发现二甲双胍具有抗肿瘤的多种生物活性，比如说能抑制乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌和神经胶质瘤等多种恶性肿瘤的生长[9,10]，主要表现为对肿瘤细胞增殖的抑制作用、对肿瘤细胞凋亡的促进作用、活化肿瘤对化疗药物的敏感性、抑制肿瘤新生血管的生成[11]。但是二甲双胍对卵巢癌细胞生长的抑制作用及机制还没有明确的定论，因此本次实验研究在体外探讨二甲双胍对卵巢癌SKOV3/DDP细胞增殖的影响，我们的实验结果初步显示，二甲双胍能够明显抑制卵巢癌SKOV3/DDP细胞增殖，并且具有浓度依赖性。

广泛应用于糖尿病治疗的药物二甲双胍，在抗癌方面作用尚不清楚，但它很可能成为治疗癌症的新药物，为前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等部位的癌症，提供新的治疗思路。根据最新研究，越来越多的流行病学和实验室证据表明，二甲双胍很可能对卵巢癌有抑制作用。如果这些作用可以被进一步证实，二甲双胍有望作为一种预防性药物或辅助治疗药物应用于卵巢癌的控制中，可以为打破卵巢癌的耐药和复发瓶颈做出贡献。不过，目前的研究仅仅局限于细胞株和动物实验，尚无大规模临床试验，今后仍需要更大样本、为期更长的病例对照或队列研究来进一步探索二甲双胍与卵巢癌的关系[12]。

[1]JemalAbray,FMelissaM.GlobalCancerStatistic[J].CaCancerJClin,2011,61( 2):69-90

[2]WangJ,GaoQ,WangD,etal.Metformininhibitsgrowthoflungadenocarcinomacellsbyinducingapoptosisviathemitochondria-mediatedpathway[J].OncolLett,2015,10(3):1343-1349

[3]KasznickiJ,SliwinskaA,DrzewoskiJ.Metforminincancerpreventionandtherapy[J].AnnTranslMed,2014,2(6):57

[4]ChaiX,ChuH,YangX,etal.Metforminincreasessensi-tivityofpancreaticcancercellstogemcitabinebyreducingCD133(+)cellpopulationsandsuppressingERK/P70S6Ksignaling[J].SciRep,2015,5:14404

[5]SanchoP,Burgos-RamosE,TaveraA,etal.MYC/PGC-1αBalanceDeterminestheMetabolicPhenotypeandPlasticityofPancreaticCancerStemCells[J].CellMetab,2015,22(4):590-605

[6]LeoneA,DiGennaroE,BruzzeseF,etal.Newperspec-tiveforanoldantidiabeticdrug:metforminasanticanceragent[J].CancerTreatRes,2014,159:355-376

[7]WintersBPlymateS,ZeliadtSB,etal.Metformineffectsonbiochemicalrecurrenceandmetabolicsignalingintheprostate[J].Prostate,2015,75(15):1694-1703

[8]LibbyG,DonnellyLA,DonnanPT,etal.Newusersofmetforminareatlowriskofincidentcancer:acohortstudyamongpeoplewithtype2diabetes[J].DiabetesCare,2009,32(9):1620-1625

[9]YuZ,ZhaoG,XieG,etal.Metforminandtemozolomideactsynergisticallytoinhibitgrowthofgliomacellsandgliomastemcellsinvitroandinvivo[J].Oncotarget,2015,6(32):32930-32940

[10]SliwinskaA,RogalskaA,MarczakA,etal.Metformin,butnotsitagliptin,enhancesWP631-inducedapoptoticHepG2celldeath[J].ToxicolInVitro,2015,29(5):1116-1123

[11]JaraJ,ALópez-MunozR.Metforminandcancer:betweenthebioenergeticdisturbancesandtheantifolateactivity[J].PharmacolRes,2015,8(5):355-360

[12] 朱 杰,孙 红.二甲双胍与卵巢癌关系的研究进展[J].国际妇产科学杂志，2014,42(1):52-56

(2016-08-03 收稿)(库雪飞 编辑)

Inhibition effect of metformin on the growth of ovarian cancer cells

LIDandan,WEIYutian,CHENYan

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedtoHospital,Tangshan063000,China)

Objective To study the inhibition effect of metformin on the growth of ovarian cancer cells.Methods Determined by MTT method to detect metformin (0 1.25,2.5,5,10,20,40,80 tendency/L) 48h of SKOV3/DDP cells survival rate.Results Metformin in SKOV3/ DDP cells with a dose dependent inhibition(P<0.05),themaximuminhibitionratewas72%.Conclusion Metformin can inhibit ovarian cancer SKOV3/DDP cell proliferation and has the concentration dependence.

Metformin.Ovarian cancer.Proliferation

李丹丹(1990-)，女，硕士研究生。研究方向：妇科肿瘤。

陈 燕。

R

A

2095-2694(2017)01-015-4