免疫磁微球在肿瘤细胞中的提取应用

滕娟+路玉英

【摘要】 目的：免疫磁微球是現代新颖的收集体液瘤细胞方法，用以发现受检患者体液中有无脱落肿瘤细胞。方法：分析比较免疫磁微球法与常规沉淀离心法收集肿瘤细胞。收集85例肿瘤患者和53例非肿瘤患者的体液，在同等体积的体液中，用免疫磁微球悬液与138例患者体液沉渣（尿液、腹水、腹腔积液、胸腔积液、乳头溢液）相混合，将收集到的可疑细胞进行常规镜检；并将138例患者体液沉渣进行沉淀离心镜检，比较两种镜检结果。结果：非肿瘤患者免疫磁微球检测方法阳性率为1.9%（1/53），沉淀离心检测方法阳性率为0（0/53）。肝癌患者免疫磁微球检测方法阳性率为91.6%（11/12），沉淀离心检测方法阳性率为33.3%（4/12）；结肠癌患者免疫磁微球检测方法阳性率为88.9%（24/27），沉淀离心检测方法阳性率为37.0%（10/27）；肺癌患者免疫磁微球检测方法阳性率为80.0%（12/15），沉淀离心检测方法阳性率为40.0%（6/15）；乳腺癌患者免疫磁微球检测方法阳性率为90.3%（28/31），沉淀离心检测方法阳性率为45.2%（14/31）。在非肿瘤患者和肿瘤患者中，免疫磁微球检测方法的肿瘤阳性检出率均高于常规沉淀离心检测方法（P<0.05）。结论：免疫磁微球检测方法轻易排除了混杂在体液沉渣中的正常细胞、破碎细胞和非细胞成分，排除干扰镜检的诸多因素，加大了筛选浓聚阳性细胞的力度，提高检测的阳性率，对肿瘤诊断有很大的效用，为临床肿瘤细胞学病理确诊提供更有效、便捷的方法。

【关键词】 免疫磁微球； 恶性肿瘤； 体液中瘤细胞

【Abstract】 Objective：IMMS is a new method of collecting body fluid tumor cells，and it is used to find out whether there is no shedding of tumor cells in the body fluid of the patients.Method：The tumor cells were collected and compared with the conventional sedimentation centrifugation method.Body fluids were collected from 85 patients with tumor and 53 patients with non tumor，in the same volume of body fluids，immune magnetic microsphere suspension and 138 patients with body fluids （urine sediment，ascites，peritoneal effusion，pleural effusion，nipple discharge） mixture，the collected suspicious cells in conventional microscopy，and separated the microscopic examination of the 138 patients with body fluids sediment precipitation centrifugal，compared the two kinds of mirror inspection results.Result：The positive rate of immune magnetic microsphere detection method in non tumor patients was 1.9%（1/53），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 0（0/53）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with hepatocellular carcinoma was 91.6%（11/12），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 33.3%（4/12）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with colon cancer was 88.9%（24/27），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 37.0%（10/27）.The positive rate of the detection method of the immune magnetic microsphere in patients with lung cancer was 80.0%（12/15），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 40.0%（6/15）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with breast cancer was 90.3%（28/31），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 45.2%（14/31）.In patients with non tumor and tumor patients，the positive detection rate of the immune magnetic microsphere detection method were higher than those in precipitation centrifugation test method（P<0.05）.Conclusion：Immune magnetic microsphere detection method easily ruled out normal cells mixed in body fluids in the sediment，broken cells and non cellular components，excluding factors interference microscopy，increase the screening concentration of positive cells in efforts to improve the positive detection rate，has a great effect on tumor diagnosis，pathological diagnosis，clinical tumor cytology more effective and convenient method.endprint

【Key words】 IMMS； Malignant tumor； Body fluids tumor cells

First-authors address：Beijing Geriatric Hospital，Beijing 100029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.038

磁性微球（Magnetic Microspheres，MMS）是近年来国内外研究的热点领域[1]。因其具有诸多的优良特性，如粒径小、具有超顺磁性、表面可修饰等，而被广泛应用于生物医学方向。其中，被应用于免疫学中的磁性微球，又被称为免疫磁性微球（Immunomagnetic Microspheres，IMMS）[2-4]，它是通过表面修饰赋予微球表面特殊的功能基，如-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH等，这些功能基团可以与特异性免疫配基相结合[4]，使抗体或抗原固定于IMMS表面，利用抗原-抗体的高度特异性识别作用，形成“抗原（抗体）-抗体（抗原）-磁性微球”结构，从而应用于细胞分离、疾病诊断、食品和环境检测等领域。当前MMS的制备方法，主要有生物来源法、共混包埋法、单体共聚法、活化溶胀法、界面沉积法、化学转化法及共沉淀法等[3]。

当体内出现恶性肿瘤后，经常有瘤细胞从肿瘤组织表面脱离、播散，侵入到血液、淋巴液中，或进入体（胸、腹、心包）腔、空腔脏器、外分泌管道中。这些脱落细胞在远隔部位可能形成转移灶，临床上如果检测到肿瘤脱落细胞，将提供至关重要的病理诊断依据[5-6]。因此，根据病情采集患者胸水、腹水、胃液、尿液、胰液、胆汁、唾液、痰液、乳头溢液、关节腔液、脑脊液等，搜寻体液中的肿瘤细胞，已成为临床诊断不可或缺的手段[7]。目前，为了收集患者体液中脱落瘤细胞，在采集待检体液后，通常经过自行沉淀和/或离心等步骤，吸取体液沉渣再进行显微镜检。少数大医院也采用流式细胞仪等手段分析体液，发现肿瘤细胞或肿瘤标志物等，当然，最终还需用显微镜进行病理细胞形态学判断。由于体液沉渣中常混杂多量正常细胞、破碎细胞和非细胞成分，不仅加大镜检工作量，而且降低了检出阳性率。为此，引用免疫磁微球材料，在显微镜检前，首先对体液沉渣进行阳性筛选。

免疫磁微球以聚苯乙烯为基质，表面包被选定的单克隆抗体，制成免疫磁微球悬液备用。肿瘤细胞免疫学研究资料表明：不同类型的恶性肿瘤细胞膜表面存在各自相对特异的抗原决定簇，有别于正常细胞，如CA125、CA153、CEA、AFP、PSA、Cyfra21-1、Ferritin等蛋白质类的膜抗原物质，就是识别瘤细胞的标志物。针对不同抗原可以制备出相应的靶向单克隆抗体，包被在微球表面，形成免疫磁微球。如将选定的免疫磁微球悬液与体液沉渣混合、保温，微球表面单克隆抗体则自动导向识别恶性肿瘤细胞膜对应的抗原决定簇，并与之结合，最终形成免疫磁微球—肿瘤细胞复合体[8-9]。随后借助磁力将复合体吸出，达到阳性筛选瘤细胞目的[10]。如此，轻易排除了混杂在体液沉渣中的正常细胞、破碎细胞和非细胞成分，排除干扰镜检的诸多因素。理论上讲，附着在肿瘤细胞上的免疫磁微球数量越多，吸附瘤细胞的磁性引力越大。为此，一方面要探求两者数量最佳比值，依据经验，加入微球量：估计细胞数=1∶10为妥；另一方面与各自体积有关。由于肿瘤细胞具有高度异质性，表面抗原密度不均，体积大小不等，直径多在15 μm左右，如果微球粒度保持在1～5 μm，可促使数个微球同时牵拉一个瘤细胞，提高筛选的阳性率。

1 材料与方法

1.1 材料 随机抽取2014年协和医院体检中心体检者（年龄≥18岁的男性或女性）53例，取尿液53份，体检者年龄42～70岁。同期协和医院传染科、消化科、内科和外科住院且临床已经确诊的肿瘤患者85例，其中肝癌患者腹水12例，年龄38～65岁；结肠癌患者腹腔积液27例，年龄44～71岁；肺癌患者胸腔积液15例，年龄26～57岁；乳腺癌患者乳头溢液31例，年龄38～59岁；患者均为经病理组织学镜检证实的确诊病例。

1.2 方法 将收集到体液，经自行沉淀和/或离心等步骤，取得体液沉渣并置入提供的专用试管中。选定一种或数种与肿瘤相关的单克隆抗体，制备相应的免疫磁微球悬液。（1）初步镜检估算体液沉渣中细胞总量=肿瘤细胞+非瘤细胞。（2）加入适量免疫磁微球悬液到体液沉渣中，相互混匀，在室温下保温，轻微震荡2 h左右。（3）反应终止后，在混合悬液中插入专用细胞提取棒，放置5 min，以充分吸附免疫磁微球—肿瘤细胞复合体。专用细胞提取棒由强磁体棒心和塑料套管两部分组成。（4）将细胞提取棒从混合悬液里移至缓冲液中。一旦抽出强磁体棒心后，磁力消失，附着在塑料套管外的免疫磁微球—肿瘤细胞复合体会自动脱离塑料套管外表面，轻轻晃动落入缓冲液中。（5）离心后，收集到的可疑细胞进行常规病理细胞学检测。见图1、2。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在同等体积的体液中，免疫磁微球检测方法的肿瘤阳性检出率均高于常规沉淀离心检测方法，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

3 讨论

当前，我国每年癌症发患者数约200万，全国每年死于癌症的人数己超过140万[11-13]，肿瘤的早期诊断是患者获得长期生存的最主要途径[14-16]，但目前肿瘤诊治主要以中晚期为主，如计算机断层扫描、超声诊斷、乳房摄影等检测的最小极限为l cm（109细胞）直径的肿瘤[17-18]。并且缺点较多，灵敏度差，特异性差，操作复杂，给患者带来不便。

从表1可以看出，在同等体积的体液中，与常规沉淀+离心方法比较，常规沉淀+离心方法由于体液沉渣中常混杂多量正常细胞、破碎细胞和非细胞成分，既加大了镜检工作量，也要求镜检工作人员的经验丰富，这些因素都可以导致肿瘤细胞阳性检出率的下降。而免疫磁微球收集法在显微镜检前，先对体液沉渣进行阳性筛选，就避免了这些不足，加大了筛选和浓聚阳性细胞的力度，明显提高检测的阳性率。endprint

免疫磁微球技术可用来分离人类各种细胞，如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞、神经干细胞，造血细胞、T淋巴细胞、人类关节滑膜细胞、树突状细胞、内皮细胞及多种肿瘤细胞等[17，19-20]。免疫磁性分离方法不仅简便快速，而且可以在接近细胞正常生活状态的情况下进行，对细胞活性无显著影响，在生理、病理、药理、微生物等领域得到广泛的应用[21-22]。

免疫磁性微球用于细胞的清除也有一些缺点，主要是在方法学、靶细胞种类、检测方法的灵敏度等方面变异性较大，但仍不失为一种安全、简便、有效的方法，为临床肿瘤细胞学病理诊断提供更有效、便捷的方法。

参考文献

[1] 岳巧艳，袁捷.免疫磁珠技术在肿瘤学领域的应用[J].东南大学学报（医学版），2010，29（1）：111-114.

[2] 康继超，沙木屯布卡，谢蜀生.用免疫磁性微球从骨髓中分离癌细胞[J].药学学报，1998，33（1）：52-56.

[3] 刘先桥，官月平，邢建民，等.磁性微球的制备及在细胞分离中的应用[J].化学通报，2004，67（10）：723-728.

[4] 谢钢，张秋禹，李铁虎.磁性高分子微球[J].高分子通报，2001，25（6）：38-45.

[5] 李传刚，李咏兰，韩志刚.免疫磁珠的制备及其在捕获乳腺癌患者白细胞中的应用[J].内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版），2014，43（1）：60-65.

[6] 刘瑜，张秋禹，刘清，等.磁性复合微球的生物偶联改性及应用研究进展[J].现代化工，2011，31（8）：13-17.

[7] 周小昀，李龙芸，郝淮杰，等.外周血循环肿瘤细胞在晚期肺癌患者的预测及预后价值研究[J].癌症进展，2010，8（5）：484-490.

[8] 程道胜，李春娇，黄黎明.外周血微转移前列腺癌细胞的免疫磁珠法检测[J].中国热带医学，2011，11（2）：219，221.

[9] 范蓉，钱和年，冯捷，等.免疫磁珠技术在卵巢癌研究中的应用[J].北京医科大学学报，1998，30（4）：367-368.

[10] Fung K F M，Senterman M，Eid P，et al.Comparison of Fourier-transform infrared spectroscopic screening of exfoliated cervical cells with standard Papanicolaou screening[J].Gynecologic Oncology，1997，66（1）：10-15.

[11] 陈媛媛，程勃然，王振盟，等.循环肿瘤细胞的检测在结直肠癌中的应用[J].中华临床医师杂志（电子版），2014，8（9）：1758-1762.

[12] 韓鸿彬，李朝辉，刘帅锋，等.胃癌患者外周血循环肿瘤细胞检测及其临床意义[J].中国普外基础与临床杂志，2015，22（7）：840-843.

[13] 俞雄斌，欧阳学农，余宗阳.循环肿瘤细胞的检测方法及其在肺癌临床中的应用[J].临床肿瘤学杂志，2013，18（2）：179-182.

[14] 韩晓芳，王晓成，王蔼明.密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测卵巢癌循环肿瘤细胞及其与肿瘤复发转移的相关性[J].中国药物与临床，2016，16（4）：460-462.

[15] 陆松梅，周琦，张娜，等.EPCAM、MUC16免疫磁珠制备及循环肿瘤细胞检测[J].免疫学杂志，2015，31（6）：517-522.

[16] 黄毅，陈忠新，谢蜀生.应用免疫磁珠·PCR技术分选及检测尿中的膀胱癌细胞[J].肿瘤防治研究，1999，26（1）：18-20.

[17] 李蕾，江泽飞.循环肿瘤细胞检测在不同阶段不同类型乳腺癌中的应用[J].中国癌症杂志，2013，23（8）：570-575.

[18] Fodstad O，Faye R，H?if?dt H K，et al.Immunobead-based detection and characterization of circulating tumor cells in melanoma patients[J].Recent Results in Cancer Research，2001，158（7）：40-50.

[19] 张健，冯晓燕，孙亭亭，等.乳腺癌循环肿瘤细胞分离鉴定试剂盒的建立[J].检验医学，2015，30（10）：1011-1016.

[20] 曹君剑，李富荣，唐渝，等.纳米免疫磁性微球的制备和性能研究[J].中国免疫学杂志，2005，21（9）：694-696，700.

[21] 邱林，杜娟，王海燕，等.利用微流控免疫磁珠分选仪高效富集外周血循环肿瘤细胞[J].第三军医大学学报，2016，38（6）：634-637.

[22] 边莉，刘毅，江泽飞.循环肿瘤细胞动态变化对转移性乳腺癌患者治疗反应及预后的预测价值[J].中华医学杂志，2014，94（4）：265-268.

（收稿日期：2016-08-24） （本文编辑：张爽）endprint