葛根素对缺氧环境下肺动脉平滑肌细胞增殖保护作用的基础研究

王莹威，李萌，王浩

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

葛根素对缺氧环境下肺动脉平滑肌细胞增殖保护作用的基础研究

王莹威，李萌，王浩

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究在高CO2低O2的环境下，葛根素对于肺动脉平滑肌细胞的影响和保护的可能机制。方法：采用胶原酶消化法原代培养大鼠PASMC后建立PASMC的缺氧模型，实验分组：对照组和葛根素不同浓度干预组，分别于缺氧环境下培养12 h、24 h、48 h后检测。倒置相差显微镜观察细胞形态，MTT法检测PASMC在缺氧环境中，在葛根素不同浓度、不同时间作用下的增殖和时间效应关系,分析葛根素的保护作用。结果：胶原酶消化法肺动脉平滑肌细胞原代培养可行性很强。葛根素干预的最佳时间是24 h、100 μg/mL。葛根素可以显著的抑制缺氧导致的PASMC的增殖,从而减轻肺血管的重构，对肺动脉高压的治疗有指导作用。结论：葛根素对缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞有保护作用，可以明显的抑制缺氧导致的PASMC增殖，减轻肺血管的重构，对缺氧性肺动脉高压有良好的治疗效果。推测其保护的机制可能与葛根素能调控Rho激酶在PASMC中的表达有关，此实验为后续的研究提供基础。

葛根素；肺动脉平滑肌细胞；缺氧；保护

肺动脉高压是不同病因导致的以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特点的一组临床综合征，发病率和死亡率很高，其发病机制主要为血管收缩、血管重构和血栓形成。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)对于肺动脉高压的研究有重大的意义，它是肺血管壁的重要组成部分，实验发现肺动脉高压的肺血管重建可以通过增加肺动脉平滑肌细胞的凋亡进行逆转[1]。缺氧会导致肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的过度增殖从而导致肺血管的重构，致使肺动脉压力进行性升高，故PASMC的增殖对缺氧性肺动脉高压的发生发展过程中起关键的作用。

葛根(Radix Puerariae)又名葛藤，葛麻叶，甜葛藤，粉葛藤等，为豆科多年生缠绕藤本植物野葛或甘葛藤(习称粉葛)的干燥根[2]。葛根始载于《神农本草经》，列为中品，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功能，是中医临床常用药。传统应用中主治伤寒中风，肠风麻疹，麻毒内陷，胃热口渴。大量现代研究表明，葛根素能有效的改善缺氧性肺动脉高压[3]。现代药理研究表明：葛根素具有修复内皮细胞、清除氧自由基、抑制平滑肌细胞增生、改善微循环、扩张冠状动脉等作用，已经广泛的应用于心脑血管及肺部疾病的治疗[4],大量研究工作显示葛根素具有降低肺动脉高压、改善肺血管重建的作用，能有效的降低慢性缺氧性大鼠的肺动脉高压和右心室肥大，但具体机制迄今未完全明了。

1 材料与方法

1.1 材料

5 mg/mL葛根素注射液，浙江康恩贝股份有限公司产品，批号981022。胎牛血清和DMEM合成培养基购自Gibco公司。胰蛋白酶(trypsin)购自Difco公司。其余试剂为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺动脉平滑肌细胞PASMC的培养

取清洁级SD成年大鼠，体质量250 g(黑龙江中医药大学提供)，用2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)常规麻醉后，75%乙醇浸泡2 min消毒。固定大鼠，在无菌条件下进行以下操作，打开胸腔，暴露心脏，在右心房处用眼科剪剪口，用装有PBS缓冲液的注射器穿刺，冲洗主动脉。放血后将心肺组织放入无菌培养皿中，加入DMEN培养液中，去除周围组织、脂肪和血污，转入新的含DMEM培养液的培养皿中。在外科手术显微镜下，用镊子仔细剥除外膜结缔组织(黑色破布状)至血管光滑透明，后用眼科剪纵向剪开，用刀片轻刮除内膜层细胞，用培养液冲洗2次后将肺动脉中膜剪成1 mm×1 mm大小的组织块，以组织块间隔5 mm的密度均匀贴放在25 mL培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液2～3 mL,轻轻顺时针晃动3圈，逆时针晃动3圈，放入37℃、5%CO2培养箱培养3～4 h。隔天进行换液，一周后鉴定。以上严格按照无菌操作。

1.2.2 肺动脉平滑肌细胞免疫组化染色鉴定

取对数期的肺动脉平滑肌细胞，于室温下进行操作，直接培养在多聚赖氨酸处理的盖玻片上，纯丙酮固定，15 min后PBS清洗，用H2O2稀释的甲醇(0.5%)作用25 min，内源性酶灭活，清洗两次，滴加正常山羊血清作用25 min，滴加抗鼠α-肌动蛋白抗体(1∶100)，4℃冷藏过夜。3次PBS清洗，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃下孵育30 min，3次清洗，滴加SABC，37℃下孵育25 min，最后DAB显色15 min。蒸馏水冲洗，复染，用二甲苯进行透明，盖玻片封片，显微镜观察。

1.2.3 缺氧模型的细胞复制

取肺动脉平滑肌细胞，放置于封闭有机玻璃盒中，盒内的气体体积分数保持在2% O2、3%CO2、95% N2，然后放入在37℃恒温浴箱恒温培养24 h。

1.2.4 细胞的冻存和复苏

选取处于生长对数期的PASMC，消化细胞5 min，将消化好的细胞收集于离心管中，1 500 rpm，离心3 min，加入提前配制好的冻存液(20%胎牛血清, 10%DMSO，70%DMEM)，轻轻吹打细胞，使其均匀，计数，将细胞浓度控制在1×107ml/L, 以每管1.5 mL的液体量分装入无菌冻存管中。-80℃的冰箱速冻3 h后，将冻存管移入液氮中。

将冻存的细胞从液氮中取出，立即放入到37℃温水中，保持快速摇晃，迅速复苏细胞。待其融化完全后取出，用酒精消毒后打开，吸管吸出细胞悬液，用吸管注入离心管，添加10倍的培养液，混合后离心，1 500 rpm 3 min，离心完成后吸弃上清液，重复上述操作，此过程在超净工作台进行，严格执行无菌操作。调整细胞浓度，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整为5×105/mL，在100 mL培养瓶接种，置于5%CO237℃的恒温培养箱中培养过夜，次日更换培养液后继续培养。

1.2.5 大鼠PASMC活力检测

采用台盼蓝排斥试验验证PASMC的活力。将培养的细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，将其浓度稀释到1×105/mL。取细胞悬液滴加到小试管内，后滴加入4%的台盼蓝溶液，滴加比例为9∶1，混匀后等待3 min，用血球计数板分别计数活细胞与死细胞。

1.2.6 葛根素对细胞增殖活性的MTT测定

将处于对数生长期的细胞悬液进行消化后,接种于96孔平底培养板，密度调为每孔5×109/L。左上角第一孔不加入任何液体，其余孔可设：(1)对照组(N)：共3复孔，每孔加入含10%血清的DMEM培养液100 μL。(2)葛根素处理组(P1～P5)：分成50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L共3个浓度，每个稀释度3个复孔，每孔中加入葛根素100 μL。然后，对照孔和葛根素处理组各孔中分别加入100 μL细胞悬液。将培养板移入培养箱(37℃、N294%、CO25%、O21%的密封箱)中培养，继续培养12 h、24 h、48 h后。各孔加入5 mg/mL的 MTT溶液10 μL，相同条件下孵育4 h后终止培养，以上操作严格按照无菌标准。终止培养后，吸弃上清液，每孔加入DMSO终止反应80 μL，充分震荡使其完全溶解。在酶联免疫检测仪上选择480 nm的波长，测定各孔光吸收值(OD值)记录结果绘制成表格。

1.2.7 统计学处理方法

2 结果

2.1 PASMCs的形态观察

采用倒置显微镜进行显微观察：细胞贴壁生长良好，细胞呈不规则的三角形或长梭形，符合肺动脉平滑肌细胞的生理特点，呈并行排列或簇状生长(图1A)，生长繁殖达到90%融合时，表现出典型血管平滑肌细胞“峰、谷”状生长的特点(图1B)。

图1 PASMC显微镜下观察图像

2.2 大鼠PASMC活力的检测

台盼蓝排斥试验证实：活细胞率>92%。

2.3 葛根素对缺氧诱导的PASMC增殖的作用

葛根素作用PASMC细胞12 h、24 h、48 h，与空白对照组比较，结果表示，在缺氧诱导PASMC增殖的过程中，缺氧时间越长细胞增殖越严重，葛根素有效的抑制了细胞的增殖(表1)。通过实验得知，葛根素对肺动脉平滑肌细胞缺氧损伤机制的有效的作用条件为100 μmol/L，24 h。

表1 葛根素对缺氧作用的肺动脉平滑肌细胞增生的抑制情况

注：与对照组比较，▲P<0.05；▲▲P<0.01

3 讨论

肺动脉高压(PAH)是指肺动脉压力升高超过一定界值的一种血流动力学和病理生理状态，既是一种独立的疾病，也可以是并发症或者综合征，严重可导致右心衰竭。其血流动力学诊断标准为：海平面静息状态下，右心导管检测肺动脉平均压≥25 mmHg。肺动脉高压是一种临床常见病、多发病，其特殊的病理生理过程使其致残率和病死率均很高，应引起人们的高度重视。

肺动脉高压是肺心病的中心环节，肺动脉高压是不同病因导致的以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特点的一组临床综合征，发病率和死亡率很高，肺动脉高压的形成是一个缓慢的过程，主要与肺血管收缩与肺血管重构有关[5]。缺氧会导致肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的过度增殖从而导致肺血管的重构，致使肺动脉压力进行性升高，故PASMC的增殖对缺氧性肺动脉高压的发生发展过程中起关键的作用[6]。已有实验表明增加PASMCs凋亡可以有效的逆转肺动脉高压肺血管重建[7]。本实验采用显微外科技术和胶原酶消化法原代培养大鼠PASMC[8]，对其进行缺氧处理，从而观察细胞在缺氧影响下的细胞增殖情况用来作为对治疗肺动脉高压的依据[9]。后用来进行葛根素相关的实验。

葛根Radix Puerariae又名葛藤，葛麻叶，甜葛藤，粉葛藤等，为豆科多年生缠绕藤本植物野葛或甘葛藤的干燥根[1]。葛根作为中医常用药材始载于《神农本草经》，列为中品，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功能，是中医临床常用药[10]。传统应用中主治伤寒中风，肠风麻疹，麻毒内陷，胃热口渴。

葛根素系豆科植物野葛干燥根中的提取物，是一种单体异黄酮化合物[11-12]，现代药理研究表明：葛根素具有清除氧自由基、修复内皮细胞、抑制平滑肌细胞增生、改善微循环、扩张冠状动脉等作用，已经广泛的应用于心脑血管及肺部疾病的治疗[7],大量研究工作显示葛根素具有降低肺动脉高压、改善肺血管重建的作用，能有效的降低慢性缺氧性大鼠的肺动脉高压和右心室肥大，但具体机制迄今未完全明了。葛根是主要成分是8-D-吡喃葡萄糖-4′, 7-二羟基异黄酮苷,研究发现这种成分具有减轻氧自由基损伤、改善微循环及抗凝[13]等作用,大量研究发现，葛根素能促进主动脉平滑肌细胞的凋亡[14-15]。葛根素改善肺动脉高压方面的课题虽不多但已有实验论证[16],实验发现应用葛根素进行肺动脉高压疾病的早期干预具有良好的降低作用,但并未阐明其具体机制。课题旨在研究葛根素治疗肺动脉高压的具体机制，本实验为后续的研究确立研究基础，提供技术支持。

肺动脉平滑肌细胞对于肺动脉高压是比较重要的实验细胞，其培养方法多种多样，目前认定的效率最高，结果最好的是酶消化法和组织贴块法，通过查询文献和实际实验操作，确立采用胶原酶消化法，其特点是重复性好，培养周期短及传代次数多的大鼠肺动脉平滑肌细胞培养方法。

肺动脉平滑肌细胞在缺氧的作用下细胞具有明显的增值病变，而细胞的增值是肺动脉高压的主要病理改变，所以以此作为对照，可以准确的对葛根素的药效进行检测。测定葛根素在不同的作用时间和不同的浓度作用下，细胞增殖病变行为是否有减轻，其测定时间的缺定是以已有研究的结果，肺动脉高压细胞在缺氧环境下12 h后就出现了细胞动力学的改变，在48 h之内病变过程趋于结束，测定此时间段的细胞增殖最为科学有效。实验测定数据后发现药物治疗后相比于对照组增值都有一定的减少，对照组12 h，24 h以及48 h的平滑肌细胞增殖结果为1.294±0.018,1.443±0.053,1.712±0.039(OD490nm)，以浓度均为50 μmol/L的葛根素治疗组为例，12 h，24 h，48 h时其细胞增殖读数为1.212±0.015，1.319±0.020,1.634±0.139，通过统计计算，其24 h结果P<0.01下降指数具有显著意义,48 h结果P<0.05下降指数具有科学意义，后根据科学的数据处理，得出最佳的作用模式，结果为葛根素治疗缺氧作用下的PASMC细胞增殖最佳作用浓度为100 μmol/L，最佳作用时间是24 h。对于已有研究中，葛根素作用浓度和时间的模糊界定有很好的确定作用，课题旨在研究葛根素治疗肺动脉高压的具体机制，本实验为后续的研究确立研究基础，提供技术支持。

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2016-10-15

2016-12-30

黑龙江省自然科学基金(H201460)

王莹威(1975-)，女，副主任医师，硕士研究生导师,研究方向：中医药治疗病毒性心肌炎，心力衰竭，冠心病的基础和临床研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)01-0024-03