结核病分子诊断研究进展

梅珍珍

(咸宁市结核病院，湖北 咸宁 437000)

结核病分子诊断研究进展

梅珍珍

(咸宁市结核病院，湖北 咸宁 437000)

结核病；分子诊断技术；进展

结核病是威胁人类健康的主要传染性疾病之一，自上世纪50年代抗生素疗法问世后，其发病率和死亡率已显著降低，然而，最近20多年来，结核病疫情大有卷土重来之势，全球的流行形势十分严峻[1]。及时发现、治疗和隔离患者是控制结核病的有效手段，而结核病诊断是发现和治疗患者的前提。近些年，分子诊断技术发展十分迅速，为结核病和耐药结核的快速诊断提供了重要手段。现将目前结核病分子诊断进展介绍如下：

1 Xpert Mtb/RIF技术

Xpert Mtb/RIF是一项发展十分迅速的结核病及耐药结核病的全自动快速分子诊断方法，该技术具有操作简便，检测快，结果准等优点，手工操作部分仅需5min，而全过程只需90min即可完成Mtb特异核酸检测和利福平耐药基因rpoB突变的检测。因此，该技术迅速得到认可及推广使用。2010年12月，WHO批准了Xpert Mtb/RIF技术的应用。2013年7月，Xpert Mtb/RIF技术通过了美国食品药品监督管理局(FDA)的认证。Xpert Mtb/RIF可在2h内得到检测结果、敏感度高、潜力巨大，目前已在结核病患病率较高的67个国家推广实施[2]。

Xpert Mtb/RIF技术诊断结核病具有检测限低，灵敏度和特异度高的优点。Van等[3]在研究中发现Xpert MTB/RIF检测法的检测低限可低至痰液中100个细菌/mL。Chang等[4]的meta分析显示，Xpert Mtb/RIF法诊断肺结核总敏感度为90.4%，特异度为98.4%，而在肺外结核诊断中合并敏感度和特异度分别为80.4%和86.1%。新加坡Teo等[5]对162份标本的诊断比较研究结果表明，与Mtb直接试验(MTD)检测(灵敏度97.3%、特异度87.1%)相比，运用Xpert Mtb/RIF技术(灵敏度90.9%、特异度89.0%)也可以准确诊断。同时，Xpert MTB/RIF技术也可用于儿童结核病诊断，并具有其他方法不具备的优越性，与直接痰涂片镜检相比，具有较高的敏感度[6-8]。

Xpert Mtb/RIF技术操作简单，检测时间短，有利于患者的早期快速诊断及耐利福平结核的治疗。Theron 等[9]在南非进行的大规模多中心随机对照临床实验研究结果显示，与痰涂片镜检相比，Xpert Mtb/RIF检测具有较高的就诊当天诊断率(24.0%和13.0%，P<0.0001)和就诊当天治疗率(23.0%和15.0%，P=0.0002)。Boehme等[10]研究显示，Xpert Mtb/RIF技术检测结核和耐药结核的中位时间分别是0 d和20 d，而菌阴结核治疗的中位时间则由56 d减少至5 d。Davis等[11]进行了一项随访2个月的前瞻性横断面研究，结果显示Xpert Mtb/RIF在不减少早期检出率的同时，能够降低94.0%的过度治疗，平均每个患者减少44 d的过度治疗，而在隔离治疗评估中，Xpert Mtb/RIF可将总隔离天数从495 d减少至30 d。

2 分子线性探针测定法

分子线性探针测定法诊断Mtb耐药基因检测已得到了WHO的认可与推荐。目前该方法主要分为3种：Genotype MDRTBsl检测法、Genotype MDRTBplus检测法和REBA MTB-Rifa线性探针测定法。

2.1 Genotype MDRTBsl检测法 目前Genotype MDRTBsl试验已应用于XDR-TB的诊断，主要用于检测氟喹诺酮类药物(FQs)、乙胺丁醇(EMB)和其他二线药物的耐药基因突变。Lacoma等[12]采用Genotype MDRTBsl和BACTECTM460 TB法检测临床分离株和临床标本的FQs、卡那霉素(Km)-卷曲霉素(Cm)和EMB药敏的总体符合率，Genotype MDRTBsl检测临床分离株的总体符合率分别为72.4%、88.9%、67.6%，而检测临床样本的符合率则分别为86.5%、92.3%、56.0%。Huang等[13]采用Genotype MDRTBsl检测法和DNA测序法对234例耐多药菌株检测耐药基因，并与传统的药物敏感度试验(DST)相比，Genotype MDRTBsl检测法测定耐药基因的敏感度(FQs为85.1%、阿米卡星为84.2%、Cm为71.4%、Km为43.2%)差别较大，而两种方法检测上述耐药基因的特异度均很高(95.8%～100.0%)。

2.2 Genotype MDRTBplus检测法 Genotype MDRTBplus检测法可用于结核病和耐利福平、异烟肼结核的诊断。Friedrich等[14]研究显示Genotype MDRTBplus检测法检测临床标本中分枝杆菌或其DNA的灵敏度可达96.8%；而RFP耐药检测结果与Xpert Mtb/RIF检测法和液体培养法的检测结果完全一致，INH耐药检测的灵敏度和特异度则分别是83.3%和100.0%。Maurya等[15]使用Genotype MTBDRplus检测法检测125株可检测到120株(96%)Mtb，检测RFP、INH和耐多药结核的敏感度分别为95.8%、96.3%、97.7%。Jin等[16]使用GenoType MTBDRplus、DNA测序和药敏试验检测237株MDR-Mtb菌株的RFP和INH耐药情况，结果显示GenoType MTBDRplus检测法对两者的敏感度分别为93.5%和75.0%，而特异度均为100.0%，但同时发现，该检测法不能检出诸如katG S315N等少见的INH耐药基因突变，因此仍需加以改进以提高对INH耐药检测的灵敏度。

2.3 REBA MTB-Rifa线性探针测定法 REBA MTB-Rifa线性探针测定法可用于检测RIF耐药基因rpoB。Cho等[17]采用REBA MTB-Rifa线性探针测定法和传统表型DST两种方法对492株Mtb临床分离株进行RFP耐药检测，结果显示有215株RFP耐药，REBA MTB-Rifa线性探针测定法对RFP耐药检测的灵敏度为98.1%、特异度为100.0%；同时还检测了228份涂片阳性的标本，该方法的灵敏度和特异度均为100.0%。

3 基因芯片技术

基因芯片技术具有简便、快速、灵敏度高、特异度高等优点。周杨等[18]用基因芯片法和绝对浓度法检测临床分离株的耐药情况，其中基因芯片法针对Mtb的rpoB、katG、inhA三个基因的多个位点进行检测，以绝对浓度法的药敏结果为金标准，基因芯片法检测RFP耐药的符合率为93.7%、灵敏度为92.0%、特异度为97.2%，检测INH耐药的符合率为83.8%、灵敏度为77.4%、特异度为96.9%，而检测耐多药的符合率为82.4%、灵敏度为74.6%、特异度为98.0%。Kurbatova等[19]对俄罗斯2个耐药结核病流行地区的238份标本使用Xpert Mtb/RIF法和TB-biochip生物芯片法同时进行检测，发现两者对MTBC的RFP耐药检测效果相似。

4 多重PCR检测技术

多重PCR检测技术采用多个特异性引物对多个不同基因靶点进行扩增，不仅具有PCR技术简便、快速的特点外，还可以减少假阴性结果。Sharma等[20]研究发现，以IS 6110作为引物的单PCR和以IS 6110、devR作为引物的多重PCR在结核病患者中的阳性率分别为84.5%和97.5%，而在临床疑似患者中的阳性率分别为40.0%和45.0%，两者的特异度均为96.5%，说明在多重PCR可在不降低特异度的同时，提高灵敏度。Chia等[21]针对INH和RFP的5个耐药基因突变位点进行多重等位基因PCR(MAS-PCR)，以药敏试验结果为参照，MAS-PCR可以较为准确的检测INH(灵敏度82.8%、特异度100.0%)和RFP(灵敏度98.4%、特异度100.0%)耐药性突变。Vadwai等[22]以katG315、rpoB531、gyrA94和rrs1401等4个位点为目标进行多重等位基因特异性PCR，检测Mtb对INH、RFP、FQs和氨基糖苷类药物的敏感性，该方法对培养阳性患者、涂阳患者、涂阴患者和培养阴性患者的检测准确率分别为97.2%、100.0%、55.5%、93.6%。

5 焦磷酸测序法

焦磷酸测序技术实际上是一种适用于对已知短序列的实时DNA测序分析技术，其重复性、精确性高，具有操作简单、检测速度快等优点。Lin等[23]通过测定ropB、inhA、katG、ahpC、gyrA、rrs突变的方法检测相应基因的突变，结果显示焦磷酸测序法的基因型耐药检测结果与表型耐药的一致性分别为INH(94.3%)、RFP(98.7%)、FQs(97.6%)、Am(99.2%)，Cm(99.2%)、Km(96.4%)；对临床菌株结核分枝杆菌复合群检测的灵敏度为98.4%，耐药检测的灵敏度为95.8%。Engström等[24]用焦磷酸测序法和药敏试验法对Mtb临床分离株进行检测，与药敏试验结果相比，焦磷酸测序法检测MDR菌株的灵敏度和特异度分别为94.6%和100.0%，检测XDR菌株的灵敏度和特异度则分别为86.9%和99.3%。Zheng等[25]的研究发现，与药敏试验结果相比，焦磷酸测序法检测临床分离株的药物耐药基因的准确度分别为INH(79.2%)、RFP(95.0%)、氧氟沙星(91.1%)、Am(96.5%)、乙胺丁醇(70.3%)、链霉素(96.5%)；检测痰标本的准确度分别为INH(83.3%)、RFP(83.3%)、氧氟沙星(91.7%)、Am(87.5%)、乙胺丁醇(60.9%)、链霉素(83.3%)。

6 恒温扩增检测技术

恒温扩增检测技术主要包括环介导恒温扩增法和RNA恒温扩增实时检测等2种方法。

6.1 环介导恒温扩增法 环介导恒温扩增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)可在等温条件下直接扩增临床标本中MtbDNA，用肉眼就可以观察结果，是2013年WHO重点推荐的一种商业化的应用于Mtb DNA扩增的诊断新方法；该法在菌阳标本和涂阴培阳标本中的灵敏度分别达到97.0%～98.2%和53.0%～62.0%，特异度为93.9%～96.3%[26]。有研究报道，IS6110-LAMP与Amplicor Mtb PCR测试、in-house IS6110-PCR和巢式PCR相比，对Mtb的灵敏度分别达到89.6%、76.6%、79.2%、59.7%，阴性预测值分别为75.0%、57.1%、60.0%、43.6%；IS6110-LAMP特异度和阳性预测值均为100.0%[27]。

6.2 RNA恒温扩增实时检测 RNA恒温扩增实时检测(simultaneous amplification and testing,SAT)法既有操作简便，反应速度快，污染率低的特点，同时还具有灵敏度和特异度高的优点，是一项很有市场前景的Mtb诊断新技术[28-29]。沙巍等[30]使用SAT、Mtb培养法和荧光PCR检测172例疑似肺结核患者痰液标本，以后两者的检测结果为金标准进行比较，SAT检测的灵敏度为97.8%(89/91)，特异度为97.5%；而以临床诊断为标准则SAT诊断的灵敏度和特异度分别为58.3%、100.0%，对菌阳患者和菌阴患者SAT检测的阳性率分别为84.9%，19.0%。

7 高分辨率熔解曲线分析

高分辨率熔解曲线分析法检测耐药基因突变，目前已在INH、RFP、Sm、FQ药物和PZA中得到验证。Pholwat等[31]采用高分辨率熔解曲线分析法对98株临床分离株的pncA基因进行分析，结果与MGIT960药敏结果进行比较发现，测序结果和高分辨率熔解曲线分析法检测的一致率为94.0%，测序结果和HRM检测与吡嗪酰胺药敏结果的一致率分别为84.0%和82.0%。Lee等[32]对92例Mtb临床分离株的gyrA，rpsL和rrs基因进行高分辨率熔解曲线分析法检测，以DNA测序结果为金标准，同DST相比，高分辨率熔解曲线分析法检测FQs耐药的灵敏度和特异度分别为74.1%和100.0%，检测链霉素耐药的灵敏度和特异度分别为87.5%和100.0%。此外，高分辨率熔解曲线分析法分析还可用于分枝杆菌的分类研究[33]。

8 质谱技术

质谱技术主要是通过形成质谱图，然后检测标本得到的质谱图与已知的数据库进行匹配后，匹配率最高的为鉴定结果，具有高敏感度、高通量和快速的特点。Zhang 等[34]综述了MALDI-TOFMS质谱技术在菌种鉴定中的应用。另外，该技术还可对结核病患者的血清蛋白进行分析，用于结核病的诊断。王琳等[35]对180例菌阴肺结核患者进行血清蛋白质组学研究，选取5个蛋白峰(1028.49,4796.56，7564.77,8048.02，11526.75)组成诊断模型，在与肺炎鉴别诊断中的总体有效率为84.2%，灵敏度为82.5%，特异度为85.9%，阳性预测值86.7%，阴性预测值为81.7%，而在鉴别肺炎、菌阴肺结核与健康者之间，总有效率则达89.4%，敏感度为84.2%，特异度为100.0%。Liu等[36]对391份血清样本(活动性肺结核180份；对照组211份，其中健康志愿者91份，肺癌患者40份，肺炎患者40份，COPD患者40份)采用SELDI-TOF质谱技术进行检测，发现有35个与结核病相关的差异表达蛋白质中，有4种蛋白峰(2554.6、4824.4、5325.7和8606.8)可以将结核病与对照组区分开，其敏感度为83.8%，特异度为84.2%。

9 其他分子诊断技术

实时定量PCR技术是可用于诊断结核，Darban-Sarokhalil等[37]采用实时定量PCR技术、直接痰检和培养三种方法对呼吸道标本进行检测，与两者的诊断结果相比较，实时定量PCR总的敏感度为90.2%、特异度为97.8%、阳性预测值为97.1%和阴性预测值为92.3%。寡核苷酸微矩阵法可检测出氟喹诺酮的耐药突变基因gyrA和gyrB，以及与阿米卡星和卷曲霉素耐药相关的rrs基因和启动子的eis基因，Zimenkov等[38]使用该法检测65株对氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、卡那霉素和卷曲霉素具有耐药性的临床分离株，结果显示检测耐氟喹诺酮的敏感度和特异度分别为98.0%和100.0%，卡那霉素为97.0%和94.0%，卷曲霉素为100.0%和94.0%。

目前纳米金探针已被广泛地用于病原体的核酸检测和区分，包括Mtb。Hussain等[39]开发了一种特异性检测MtbC的快速纳米金粒子(14 nm)，对Mtb的16SrDNA区域进行PCR扩增，并对未扩增的DNA基因使用纳米金检测。结果显示检测的45例DNA基因阳性样本与自动化液体培养系统(Bactec MGIT)和半巢PCR的结果完全符合(一致率100.0%)，检测用时1h。

速度-寡结核分枝杆菌直接测定法可直接检测标本中的MtbC,并可鉴别MtbC和NTM，有研究者采用速度-寡结核分枝杆菌直接测定法对566份样品进行检测，结果显示SO-DMT的灵敏度为76.0%，特异度为99.0%，阳性预测值85.0%，阴性预测值97.0%[40]。

基因探针扩增直接试验是一种直接在标本中检测Mtb的技术，具有灵敏度高等优点。Papaventsis等[41]使用基因探针扩增直接试验检测儿童结核病标本，其灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为100.0%、85.0%、50.0%、100.0%。

另外，目前还有诸如变性高效液相色谱分析、PCR限制性酶切分析以及直接测序法等分子诊断技术被大量研究开发和证实。

10 小 结

结核病分子诊断技术通常具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异度高等优点，但同时也存在着成本高，实验环境要求严格，不便于基层推广等现实性问题，且分子诊断结果通常只能做辅助诊断。因此，目前仍期待一款新的实用的低成本、反应条件要求低的结核病分子诊断技术。

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2016-09-13)