大别山牛CART基因多态性与体尺性状相关性研究

赵拴平, 徐 磊, 贾玉堂

(安徽省农业科学院畜牧兽医研究所, 安徽 合肥 230031)

大别山黄牛是我国优良的地方品种牛，主要产于安徽省大别山东部的金寨﹑岳西﹑六安等县和湖北省大别山西部的黄陂﹑大悟﹑英山等县，是大别山地区著名的地方品种。大别山牛体型小、耐粗饲、适应性强、抗病力强、容易管理，是我国宝贵的地方牛遗传种质资源。

CART基因(可卡因-苯丙胺调节转录肽基因，Cocaine-and amphetamine-regulated transcript)是一种类生长抑制素多肽，最早从绵羊下丘脑抽提物中分离获得[1]，研究发现，CART基因参与动物摄食、能量代谢调节、应激反应等多种生理过程。E.Valle等研究发现CART基因位于牛20号染色体[2]，包含3个外显子和2个内含子，SNP位点主要集中在基因的内含子和启动子区[2-3]，牛CART基因SNPs位点与生长性状关联分析发现，多态性位点A1A1(C1)基因型个体的体重显著高于A1B1基因型个体(P<0.05)，A2A2(C2)基因型个体的体重显著低于A2B2基因型个体(P<0.05)[3]。

本研究依据牛CART基因序列(NC_007318.6)设计引物，利用PCR、测序和生物信息学技术分析大别山牛CART基因SNPs位点与体尺性状的相关性，以期为大别山牛品种资源保护和开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验样品为安徽大别山黄牛血样300份，样本间无亲缘关系，颈静脉采血法采集每头牛血液10 mL，ACD 抗凝，低温带回实验室，-80℃冰箱冻存备用。

1.2 基因组DNA提取

利用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行血液样品基因组提取，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，核酸分析仪测定其纯度和浓度。

1.3 基因组DNA池构建及PCR扩增

分别取20份大别山牛稀释DNA样各1.0 μL，混合均匀，构建4个独立大别山牛基因组DNA池。

根据GenBank公布的牛CART基因序列(NC_007318.6)，利用Primer 5.0软件设计引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为：1 μL DNA，12.5 μL 2× Taq PCR Master mix(KT201)，正反向引物各1.0 μL(100 ng/μL)，去离子水补充至25 μL；扩增条件为：95℃预变性5 min；32个循环(95℃变性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸1 min)；72℃总延伸5 min。扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 SNP分析及数据处理

利用PCR扩增和测序技术分析CART基因SNP位点，测序结果利用Mutation Surveyor V4.0.8软件[4]进行分析，获得其分型结果。根据群体遗传学理论计算等位基因和基因型频率，统计大别山牛群体CART基因多态位点的基因纯合度(Ho)、基因杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)，利用SPSS17.0软件GLM模型分析SNP位点与大别山黄牛群体体尺性状的相关性。

2 结果与分析

2.1 大别山牛CART基因突变区域的PCR扩增

利用合成引物(表1)进行PCR扩增，所得产物用1%琼脂糖凝胶检测。结果表明，扩增片段与目的片段长度一致，且条带清晰、特异性好，可用于后期测序分析。

表1 大别山牛CART基因变异位点扩增引物信息

图1 大别山牛CART基因突变区域 PCR 扩增M. DNA相对分子质量标准 D2000；A. F1R1区域 B. F2R2区域

2.2 大别山牛CART基因突变区域的序列测定和遗传多态性分析

PCR测序结果发现，大别山牛CART基因第一内含子存在T253C变异，存在TT、TC和CC三种基因型(图2A)，第二内含子存在A1467G变异，有AA、AG和GG三种基因型(图2B)。从群体遗传学角度分析大别山牛CART基因各突变位点的等位基因频率、基因型频率、基因纯合度、杂合度以及有效等位基因数和多态信息含量的遗传指标(表2)，T253C处TT是优势基因型，T为优势等位基因，处于低度多态状态；A1467G处AA是优势基因型，A为优势基因， 处于低度多态状态。同时卡方检验表明，T253C处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)，而A1467G处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

2.3 CART基因多态位点与大别山牛群体尺性状的关联性分析

对大别山牛CART基因T253C和A1467G位点进行PCR测序统计分析后，依据SPSS17.0 GLM 线性模型分析300头大别山牛(成年)个体不同基因型与体高、十字部高、胸围、腹围、管围、腰角宽和坐骨端宽的相关性(表3)。

由表3可知，第一内含子T253C位点不同基因型在体高和腹围方面差异显著(P<0.05)，TT和TC基因型个体均值显著高于CC基因型个体；而其他体尺性状方面基本遵循TT和TC基因型个体均值略高于CC基因型个体均值的趋势，但差异不显著(P>0.05)。第二内含子A1467G位点不同基因型在管围和腰角宽方面差异显著(P<0.05)，AG基因型个体均值显著高于AA和GG基因型个体；而其他体尺性状方面基本遵循AG基因型个体均值略高于AA和GG基因型个体均值的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

图2 大别山牛CART基因突变区域测序图谱

SNP位点基因型频率基因频率HWE多样性参数(χ2)PHoHeNePICT253CTTTCCCTC0.900.090.010.940.069.180.010.8890.1111.1250.105A1467GAAAGGGAG0.720.260.020.850.150.010.990.7410.2591.3500.226

表3 大别山黄牛CART基因多态位点与体尺性状的相关性分析

注:肩标不同小写字母(a，b)表示差异显著(P<0.05)；相同字母或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)

3 讨论

Mutation Surveyor V4.0.8是由SoftGenetics公司开发的一款序列变异分析软件，能够高效准确地分析基因纯合子或杂合子的SNPs、缺失、插入等[4-5]。本研究利用测序技术和Mutation Surveyor V4.0.8软件分析鉴定CART基因第一内含子T253C变异和第二内含子A1467G变异，该变异位点均位于内含子区域，均不编码蛋白质序列，但目前研究显示，内含子可能在基因的表达调控中发挥重要作用，如牛CAPN1基因第14内含子C4685T变异与体重显著相关(P<0.05)[6]，IGFBP-3基因第2内含子C>A变异与海福特牛初生重和体重显著相关(P<0.05)[7]。可见，CART基因T253C和A1467G变异可能不同程度影响CART蛋白的活性，进而影响其有关的生长发育性状。

本试验结果表明，大别山牛CART基因T253C和A1467G位点均表现为低度多态，但具备适度选择的空间；χ2检验显示，CART基因T253C位点处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)， 说明其在自然选择和人工选育过程中可能会被逐渐淘汰，也可能与大别山牛品种本身有关；CART基因A1467G位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，说明在人工选育、迁徙和遗传漂变等外界因素作用下，该基因座处于动态平衡中，并且对大别山牛的体尺指标有一定影响。大别山牛CART基因各突变位点不同基因型与体尺性状的关联性分析表明：T253C和A1467G突变位点的不同基因型与体高、腹围、管围和腰角宽显著相关(P<0.05)，由此推测T253C和A1467G位点可能影响大别山牛的体尺性状指标。CART基因可能是影响大别山牛体高、腹围、管围和腰角宽体尺性状的主效QTL或与之紧密连锁，此外，张春雷[8]研究发现，CART基因C2基因座与24月龄南阳牛体重、体斜长、胸围显著相关(P<0.05)，C3基因座与24月龄体斜长显著相关(P<0.05)，C4基因座与24月龄体重和体斜长显著相关(P<0.05)，进一步证明CART基因可以尝试作为我国地方牛新品系培育的辅助选择标记。然本实验由于成本、试验条件等因素制约，致使研究样本量较小，且只限于大别山牛自身体尺性状的关联分析，所以，今后对CART基因的研究要进一步深入，以便得出较为详尽的试验结论，更好地为我国地方牛新品系的培育提供理论依据和实践基础。

4 结论

CART基因SNPs对大别山牛体高、腹围、腰角宽和坐骨端宽的体尺性状均有不同程度的影响，可以尝试将其作为大别山牛新品系培育的主效候选基因或与主基因紧密连锁的分子标记。

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[8] 张春雷. 黄牛能量平衡调控候选基因遗传变异及其与生长性状相关分析[M]. 西北农林科技大学, 2007.