SMG-1基因对缺氧卵巢癌细胞SKOV3增殖、凋亡的影响及其机制

张展，宋华，杜尚珂，石瑛，朱海

(1郑州大学第三附属医院，郑州450052；2商丘医学高等专科学校)

·基础研究·

SMG-1基因对缺氧卵巢癌细胞SKOV3增殖、凋亡的影响及其机制

张展1,2，宋华1，杜尚珂1，石瑛1，朱海1

(1郑州大学第三附属医院，郑州450052；2商丘医学高等专科学校)

目的 观察缺氧状态下卵巢癌SKOV3细胞中生殖器形成抑制基因1(SMG-1)的表达变化，及沉默SMG-1对SKOV3细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法 培养卵巢癌SKOV3细胞，分为常氧组和缺氧组，其中缺氧组以终浓度150 μmol/L的二氯化钴进行缺氧处理；48 h后分别采用qRT-PCR法和Western blotting法检测SMG-1 mRNA、蛋白。取缺氧处理的SKOV3细胞分为A、B、C、D组，A组为空白对照，B组转染阴性对照，C组仅加入转染试剂，D组转染SMG-1 siRNA。四组分别于转染48 h后测算细胞增殖抑制率、凋亡率，采用qRT-PCR法检测STAT3 mRNA，采用Western blotting法检测STAT3、p-STAT3蛋白。结果 与常氧组相比，缺氧组SMG-1 mRNA及蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。以A组为参照(0)，D组细胞增殖抑制率升高，与B、C组相比，P均<0.05。与其余3组相比，D组细胞凋亡率升高，STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论 缺氧状态下卵巢癌SKOV3细胞中SMG-1表达上调；沉默SMG-1表达后SKOV3细胞增殖受到抑制、凋亡增多；SMG-1影响卵巢癌细胞增殖、凋亡的机制可能与改变STAT3的表达有关。

卵巢癌；生殖器形成抑制基因1；缺氧；细胞增殖；细胞凋亡；转录激活因子3

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，早期诊断非常困难，病死率高，发病机制尚不明确。研究[1]发现，作为一种实体肿瘤，卵巢癌组织内存在缺氧微环境，缺氧在卵巢癌进展过程中扮演至关重要的角色，可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、迁移等生物学行为。生殖器形成抑制基因1(SMG-1)是磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶(PIKKs)家族成员之一，参与无义介导的mRNA降解(NMD)途径[2,3]。此外，SMG-1还参与细胞生长、增殖、缺氧及凋亡等多个生物进程，甚至可抑制肿瘤的进展[4～7]。本研究观察了缺氧状态下卵巢癌SKOV3细胞中SMG-1基因、蛋白的表达变化，及沉默SMG-1对SKOV3细胞增殖、凋亡的影响，并对其可能机制进行初步探索，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人卵巢癌SKOV3细胞为本课题组保存；RPMI1640培养基购于HyClone生物制品公司；血清购于杭州四季青公司；SMG-1 siRNA购于广东锐博生物公司；转染试剂Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；SMG-1(V72)抗体购于美国Cell Signaling公司；STAT3、p-STAT3抗体购于美国Abcam公司；qRT-PCR相关试剂购于日本TOYOBO公司；Annexin V/PI试剂盒购于美国BD公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁研究所。

1.2 细胞培养及缺氧处理 SKOV3细胞在5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，使用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清)。待细胞对数生长期时经0.25%胰酶消化后以1.0×105/孔接种于6孔板中，细胞长满50%～60%时开始缺氧处理。将细胞分为常氧组和缺氧组。缺氧组加入终浓度150 μmol/L的二氯化钴，常氧组常规培养。48 h后分别采用qRT-PCR法和Western blotting法检测SMG-1 mRNA、蛋白。

1.3 细胞分组及SMG-1沉默方法 取缺氧处理的SKOV3细胞(参照“1.2”处理方法)，缺氧24 h后分为A、B、C、D组。A组为空白对照，不加siRNA和Lipofectamine2000；B组加入空载siRNA(阴性对照)和Lipofectamine2000；C组仅加入Lipofectamine2000；D组加入SMG-1 siRNA和Lipofectamine2000。转染6 h后更换完全培养基(含10%胎牛血清及150 μmol/L的二氯化钴)，恒温箱继续培养48 h后分别经qRT-PCR法和Western blotting法验证SMG-1 siRNA的沉默效果，D组SMG-1表达量明显低于A、B、C组(P均<0.05)且D组与A组相比SMG-1表达抑制率>50%。

1.4 细胞增殖观察 各组转染48 h后更换新鲜培养基，再加入CCK-8试剂；此外另设一组不含细胞只有新鲜培养基和CCK-8的空白组(CCK-8试剂与培养基比例均为1∶10)；37 ℃避光孵育2 h后在波长450 nm处检测各组吸光度(A)值。以(A对照组-A实验组)/(A对照组-A空白组)计算各组细胞增殖抑制率。

1.5 凋亡细胞检测 转染48 h后用胰酶(不含EDTA)消化收集各组细胞，用冷的PBS洗涤细胞2次后加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞，然后依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min后以流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.6 缺氧SKOV3细胞中转录激活因子3(STAT3) mRNA及蛋白检测 TRIzol法分别提取A、B、C、D组细胞总RNA，按照反转录试剂盒及qRT-PCR试剂的操作说明进行操作，检测各组细胞中的STAT3 mRNA。STAT3基因上游引物序列为5′-AGGATAGAGATAGACCAGTGGAGAC-3′，下游引物序列为5′-TCAGTGAAAGCAAAGAAGG-3′，产物长度197 bp；内参基因β-actin上游引物序列为5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物序列为5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3′，产物长度185 bp。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。RIPA法分别提取A、B、C、D组细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，每组蛋白上样量40 μg。采用120 V恒压进行SDS-PAGE电泳，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(稀释比例1∶1 000)4 ℃过夜，TBS洗涤后孵育二抗(稀释比例1∶5 000)，TBST洗涤后通过ODYSSEY Clx检测与成像系统进行结果分析，计算蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 缺氧组与常氧组SMG-1 mRNA、蛋白表达比较 缺氧组SMG-1 mRNA、蛋白相对表达量分别为4.19±0.94、0.58±0.11，常氧组分别为1.12±0.17、0.26±0.06。与常氧组相比，缺氧组SMG-1 mRNA及蛋白相对表达量升高(P均<0.05)。

2.2 A、B、C、D组细胞增殖抑制率、凋亡率比较 以A组为参照(0)，D组细胞增殖抑制率高于B、C组(P均<0.05)。D组细胞凋亡率高于其余3组(P均<0.05)。详见表1。

表1 四组细胞增殖抑制率、凋亡率比较±s)

注：与B、C组比较，*P<0.05；与A、B、C组比较，△P<0.05。

2.3 A、B、C、D组细胞中STAT3 mRNA及蛋白表达比较 与其余三组相比，D组STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。详见表2。

表2 四组细胞中STAT3 mRNA及蛋白、p-STAT3蛋白相对表达量比较±s)

注：与A、B、C组比较，*P<0.05。

3 讨论

近年研究发现，实体肿瘤内部细胞往往处于不同程度的缺氧状态，缺氧微环境与肿瘤的进展密切相关，卵巢癌也是如此。SMG-1作为一种新型的肿瘤相关因子引起了越来越多学者的关注。研究[6]显示，缺氧条件下SMG-1可被激活且对HIF-1α有负向调节作用。本研究采用二氯化钴对人卵巢癌SKOV3细胞进行缺氧处理，发现缺氧状态下SKOV3细胞中SMG-1表达水平升高，提示缺氧可诱导SMG-1表达，与相关研究结果一致，而缺氧诱导SMG-1表达的相关机制尚需进一步探索。

多项研究发现SMG-1与多种细胞系的凋亡有关，如沉默SMG-1后人骨肉瘤U2OS细胞凋亡明显增多[8]，SMG-1可通过保持秀丽隐杆线虫体内细胞端粒完整性从而抵抗细胞凋亡[2]，抑制SMG-1表达可促使人绒毛膜癌JAR细胞系发生凋亡[9]，在头颈部鳞癌、肝细胞癌、胰腺癌等的相关研究也得出了类似结论[10～15]。综合已有的研究结果可看出，SMG-1的功能在不同种属间及不同细胞间可能具有多元性和复杂性。为研究缺氧状态下SMG-1对人卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响，我们设计si-RNA沉默SMG-1表达后，发现SKOV3细胞增殖抑制率和凋亡率增高，推测在缺氧微环境下SMG-1可能有抑制卵巢癌细胞凋亡的作用，而沉默SMG-1可促进缺氧的SKOV3细胞凋亡。

已有研究[5,15]证实，SMG-1可通过抑制TNF-α诱导的细胞凋亡通路来抑制细胞凋亡。有学者[11,16]发现，SMG-1能通过抑制mTOR通路调控细胞生长，其中mTOR可通过调节凋亡蛋白表达从而调控细胞凋亡。为进一步探究SMG-1对SKOV3细胞凋亡的影响机制，本研究检测了SKOV3细胞中凋亡相关因子STAT3基因及蛋白。STAT家族包括7个成员(STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6)，其中对STAT3的研究较为深入。STAT3在不同因子刺激下可发生丝氨酸(Ser727)或酪氨酸(Tyr705)残基位点的磷酸化，形成p-STAT3，进而形成二聚体转入细胞核内，发挥一系列精密的调控作用。STAT3在包括卵巢癌在内的很多人类肿瘤中可被持续性激活且具有抗凋亡活性[17,18]。有研究[19]发现，阻断JAK2/STAT3可通过线粒体凋亡通路诱导细胞发生凋亡。在卵巢癌细胞系中，沉默STAT3可使细胞增殖受抑制、凋亡增加[20]。本研究结果显示，沉默SMG-1的SKOV3细胞中STAT3 mRNA、STAT3蛋白、p-STAT3蛋白相对表达量下调，表明SMG-1在参与细胞凋亡过程中还可对其他凋亡相关因子表达产生影响，推测SMG-1对细胞凋亡的作用可能与改变STAT3的表达有关，但这需要后续实验进行验证。

综合本次研究结果，我们认为，缺氧可诱导卵巢癌SKOV3细胞中SMG-1表达上调，而沉默SMG-1表达后SKOV3细胞增殖受抑制、凋亡增多，推测SMG-1对卵巢癌细胞的促凋亡作用机制可能与影响STAT3表达有关。

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张展(E-mail： zhangzhanzdsfy@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.008

R392.12

A

1002-266X(2017)03-0029-03

2016-09-25)