糖尿病肾病患者血清抗衰老蛋白Klotho表达变化及意义

鲁勤波，高艳青

(鄂钢医院，湖北鄂州436000)

糖尿病肾病患者血清抗衰老蛋白Klotho表达变化及意义

鲁勤波，高艳青

(鄂钢医院，湖北鄂州436000)

目的 探讨抗衰老蛋白Klotho在糖尿病肾病发生、发展中的作用。方法 选择经肾组织活检明确诊断为糖尿病肾病的患者126例，肾穿刺病理分型为Ⅰ级36例(观察Ⅰ组)、Ⅱ级44例(观察Ⅱ组)、Ⅲ级46例(观察Ⅲ组)，同期无肾功能损伤的2型糖尿病患者45例作为对照组。比较各组一般资料、生化相关指标、肾小球硬化率(ROG)、血清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、8-异前列腺素F2α(8-Iso-PGF2α)、TNF-α、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平及血清Klotho mRNA相对表达量。结果 各组性别、年龄、收缩压、舒张压、BMI、糖化血红蛋白(HbA1C)和TC比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。观察Ⅱ组和观察Ⅲ组糖尿病病程均长于观察Ⅰ组和对照组，且观察Ⅲ组糖尿病病程更长(P均<0.05)。观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)均高于对照组，且观察Ⅲ组升高最明显(P均<0.05)。观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α、TGF-β1水平均高于对照组，血清Klotho mRNA相对表达量均低于对照组，且观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组尿蛋白、ROG逐渐升高，GFR逐渐降低，组间两两比较P均<0.05。糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG及血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α和TGF-β1水平均呈负相关(r分别为-0.624、-0.751、-0.696、-0.708、-0.829、-0.895、-0.924和-0.795，P均<0.05)，与GFR呈正相关(r=0.702，P<0.05)。结论 糖尿病肾病患者血清Klotho表达水平降低，且与病情严重程度有关；Klotho可能通过抑制氧化应激、炎症反应及肾间质纤维化而参与糖尿病肾病的发生、发展。

糖尿病肾病；2型糖尿病；Klotho；氧化应激；炎症反应；肾间质纤维化

糖尿病肾病是导致糖尿病患者死亡的重要原因[1]。以往采用蛋白尿水平对患者病情进行临床分级，并不能反映肾脏病变的真实情况，且无法排除其他以蛋白尿为主要表现的非糖尿病肾脏病变。临床为对糖尿病肾病进行准确分级，明确病变的严重程度，越来越多的单纯糖尿病肾病需行肾活检。Klotho是调控衰老的相关基因，与多种疾病的发生、进展及预后密切相关[2，3]。Klotho具有抗氧化应激作用，可通过抑制炎症反应而保护糖尿病患者的肾功能[3]，可作为预测性标志物[4]。目前临床关于Klotho在糖尿病肾病发生、发展中的作用报道较少，为此我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年8月～2015年8月在我院住院治疗的糖尿病肾病患者126例，男59例、女67例，年龄(54.2±6.4)岁。纳入标准：①均为2型糖尿病[2]患者；②均行肾组织活检以排除其他肾脏疾病，明确诊断为糖尿病肾病。排除标准：①1型糖尿病或继发性糖尿病所致的糖尿病肾病者；②原发性或继发性肾小球、肾小管、肾间质病变者；③近1个月出现糖尿病急性并发症者；④急、慢性感染者，肝、肾、心脏功能障碍者，高血压、恶性肿瘤患者，免疫系统疾病者；⑤妊娠或哺乳期妇女。根据肾组织活检检查结果，参照美国肾脏病学会关于糖尿病肾病病理分型标准[5]，Ⅰ级36例(观察Ⅰ组)、Ⅱ级44例(观察Ⅱ组)、Ⅲ级46例(观察Ⅲ组)。选择同期在我院内分泌科住院治疗、无肾功能损伤的2型糖尿病患者45例作为对照组，男19例、女26例，年龄(55.0±6.7)岁。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 观察指标

1.2.1 一般资料 记录各组性别、年龄、糖尿病病程、血压(收缩压和舒张压)、BMI。

1.2.2 生化相关指标 采用全自动生化仪检测尿蛋白、糖化血红蛋白(HbA1C)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、TC，计算肾小球率过滤(GFR)。

1.2.3 肾小球硬化率(ROG) 糖尿病肾病患者根据肾组织活检结果计算ROG，ROG=硬化肾小球数/肾小球总数×100%。

1.2.4 炎症、氧化应激相关指标 抽取各组晨起空腹静脉血6 mL，于4 ℃条件下3 000 r/min离心15 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱中备检。采用ELISA法检测血清单核细胞趋化蛋白1(MCP-1，试剂盒购自美国R&D公司)、8-异前列腺素F2α(8-Iso-PGF2α，试剂盒购自美国Cayman公司)、TNF-α(试剂盒购自美国Sigma公司)和转化生长因子-β1(TGF-β1，试剂盒购自美国R&D公司)水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 血清Klotho mRNA相对表达量 采用实时荧光定量PCR法。参照上法抽取各组晨起空腹静脉血后制备血清，采用TRIzol总RNA提取试剂盒(购自美国Biomiga公司)对总RNA进行提取，利用紫外分光光度计检测样品纯度，以A260/A280≥1.80为合格样品。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板采用PCR试剂盒进行PCR反应。Klotho基因及内参引物序列均由上海生工生物公司设计合成，Klotho上游引物：5′-ACCTGGTGGCGCACAC-3′，下游引物：5′-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3′；GAPDH上游引物：5′-GACCTGGTGGCGCACAC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反应条件：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、45 s，连续进行36个循环，每个样品均设置3个平行反应复孔。以2-ΔΔCt法计算血清Klotho mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 各组性别、年龄、收缩压、舒张压和BMI比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。观察Ⅱ组和观察Ⅲ组糖尿病病程均长于观察Ⅰ组和对照组，且观察Ⅲ组糖尿病病程更长(P均<0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察Ⅰ组比较，#P<0.05；与观察Ⅱ组比较，△P<0.05。

2.2 各组生化相关指标比较 各组HbA1C和TC比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组尿蛋白、ROG逐渐升高，GFR逐渐降低；组间两两比较P均<0.05。观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组Scr、BUN均高于对照组，且观察Ⅲ组升高最明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组生化相关指标比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察Ⅰ组比较，#P<0.05；与观察Ⅱ组比较，△P<0.05。

2.3 各组血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α水平和Klotho mRNA相对表达量比较 见表3。

表3 各组血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α、TGF-β1水平和Klotho mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察Ⅰ组比较，#P<0.05；与观察Ⅱ组比较，△P<0.05。

2.4 糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与其他指标的关系 Spearman相关分析显示，糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG及血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α和TGF-β1水平均呈负相关(r分别为-0.624、-0.751、-0.696、-0.708、-0.829、-0.895、-0.924和-0.795，P均<0.05)，与GFR呈正相关(r=0.702，P<0.05)。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者的常见微血管并发症之一，是导致终末期肾病的最常见原因。主要依靠尿微量白蛋白是目前临床诊断早期糖尿病肾病的常用指标，但其不能反映肾小球硬化的严重程度，同时易受感染、发热等因素影响。肾组织活检是肾脏疾病诊断及病情评估的金标准，但具有侵入性，临床应用受到限制[6]。因此积极寻找一种可反映糖尿病肾病病情严重程度的指标对指导治疗及改善患者预后具有重要意义。Klotho是一种抗衰老基因，主要表达于肾脏远曲小管上皮细胞和脑脉络膜，在调控衰老过程及与衰老相关疾病中发挥重要作用，研究表明，Klotho在氧化应激损伤小鼠髓内集合管细胞中表达下降，而提高Klotho表达具有保护肾脏功能的作用，可作为糖尿病肾病早期诊断的生物标志[7～9]。

本研究显示，观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清Klotho mRNA相对表达量均低于对照组，且观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组逐渐降低，说明糖尿病肾病患者血清Klotho基因表达下降，且与患者的病理分型有关，病理分型越高，血清Klotho表达越低。Spearman相关分析显示，糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与糖尿病病程、尿蛋白、Scr、ROG均呈负相关，与GFR呈正相关，进一步说明血清Klotho mRNA相对表达量与糖尿病肾病患者的病情严重程度有关。

研究表明，炎症、氧化应激是急、慢性肾病的发病机制之一[10]。MCP-1、8-Iso-PGF2、TNF-α是反映炎症和氧化应激反应的重要指标[11]。本研究观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α水平均高于对照组，且观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组上述指标依次升高，组间比较均有统计学差异。说明糖尿病肾病患者发生了炎症、氧化应激反应，且与病理分级有关。Spearman相关分析显示，糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与MCP-1、8-Iso-PGF2α、TNF-α均呈负相关，提示Klotho可能与抗氧化应激、炎症反应有关[12]。

TGF-β1是糖尿病肾病发生、进展中重要的细胞因子，可诱导肾小管和肾小球细胞肥大，抑制细胞外基质降解，引发肾间质纤维化[13]；亦参与尿蛋白的形成，与肾小球硬化密切相关[14]。本研究观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组血清TGF-β1水平均高于对照组，且观察Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组上述指标依次升高，说明TGF-β1参与了糖尿病肾病的病理进展过程。Pearson相关分析显示，糖尿病肾病患者血清Klotho mRNA相对表达量与TGF-β1水平呈负相关，提示Klotho降低可能与其抑制肾间质纤维化及肾小球硬化有关。

综上所述，糖尿病肾病患者血清Klotho表达降低，且与病情严重程度有关，有望成为判断患者病理严重程度的生物学指标。Klotho可能通过抑制氧化应激、炎症反应及肾间质纤维化而参与糖尿病肾病的发生、发展，但具体作用机制尚待进一步研究。

[1] Parving HH, Rossing P. Diabetic nephropathy in 2014: improved cardiorenal prognosis in diabetic nephropathy[J]. Nat Rev Nephrol, 2015,11(2):68-70.

[2] 王越,李启富.炎症与糖尿病肾病新进展[J].中华糖尿病杂志,2015,7(11):706-708.

[3] 常晋瑞,孙娜,南瑛,等. Klotho的研究进展[J].生理科学进展,2015,46(4):245-249.

[4] Zhang C, Liang Y, Lei L. Hypermethylations of RASAL1 and KLOTHO is associated with renal dysfunction in a Chinese population environmentally exposed to cadmium[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2013,271(1):78-85.

[5] Tervaert TW, Mooyaart AL, Amann K, et al. Pathologic classification of diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2010,21(4):556-563.

[6] 周颖,陈纤纤,冯烈.Smadl与糖尿病肾病的研究进展[J].中华内分泌代谢杂志,2015,31(5):468-470.

[7] Kim JH, Hwang KH, Park KS, et al. Biological Role of Anti-aging Protein Klotho[J]. J Lifestyle Med, 2015,5(1):1-6.

[8] 吴灿, 秋月,吕川,等.2 型糖尿病患者血清抗衰老蛋白Klotho的临床意义[J].中华糖尿病杂志,2015,7(3):177-181.

[9] 沈明,严玉澄,路丽明,等.H2O2抑制小鼠肾小管上皮细胞Klotho的表达[J].中华肾脏病杂志,2015,31(8):598-603.

[10] Prats M, Font R, García-Ruiz C, et al. Acute and sub-acute effect of ferric carboxymaltose on inflammation and adhesion molecules in patients with predialysis chronic renal failure[J]. Nefrologia, 2013,33(3):355-361.

[11] 徐倩,张方华,姚民秀,等.单核细胞趋化蛋白1和8异前列腺素F2α与糖尿病肾病相关性的实验研究[J].中国医科大学学报,2010,39(4):269-271.

[12] Oh HJ, Nam BY, Lee MJ, et al. Decreased circulating klotho levels in patients undergoing dialysis and relationship to oxidative stress and inflammation[J]. Perit Dial Int, 2015,35(1):43-51.

[13] Shen N, Lin H, Wu T, et al. Inhibition of TGF-β1-receptor posttranslational core fucosylation attenuates rat renal interstitial fibrosis[J]. Kidney Int, 2013,84(1):64-77.

[14] Zhang YJ, Tian ZL, Yu XY, et al. Activation of integrin β1-focal adhesion kinase-RasGTP pathway plays a critical role in TGF beta1-induced podocyte injury[J]. Cell Signal, 2013,25(12):2769-2779.

高艳青(E-mail: 1564570864@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.029

R587.2

B

1002-266X(2017)04-0085-03

2016-02-03)