显齿蛇葡萄提取物的体内和体外降血糖效果

张 斌

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002)

显齿蛇葡萄提取物的体内和体外降血糖效果

张 斌

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002)

目的 探讨不同显齿蛇葡萄提取物体外降血糖及抗氧化和体内降血糖效果研究。方法 利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇提取显齿蛇葡萄中的活性成分，得到不同提取物，测定其中总酚和总黄酮的含量，考察对α-葡萄糖苷酶的抑制效果和对DPPH及ABTS的清除效果，体内降血糖效果是利用链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型，正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)和70%的乙醇提取物(EE)按剂量200 mg/kg体重治疗4 w，每周末尾部动脉取血测定血糖，4 w后眼眶取血测定血清胰岛素。结果 不同提取物中，EE中总酚类物质和总黄酮来物质的含量最高，其次是ME，HE中该两种成分含量最低，体外降血糖效果发现EE对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制活性并且体现剂量依赖性，体外抗氧化实验发现EE对DPPH和ABTS具有较强的清楚效果，而体内降血糖效果发现不同提取物对糖尿病小鼠具有一定的降血糖效果，特别是EE组降血糖效果非常明显，血清胰岛素的含量得到明显提高。结论 显齿蛇葡萄70%EE具有明显的抗氧化和降血糖效果，是一种具有很大潜力的降血糖和抗氧化的天然药物。

显齿蛇葡萄；降血糖；α-葡萄糖苷酶；抗氧化

糖尿病及其并发症严重威胁人类健康，在各类疾病中死亡率居第3位〔1〕。植物提取物的降血糖作用已得到证实〔2～5〕。显齿蛇葡萄属于葡萄科蛇葡萄属藤本植物，主要分布于华中和西南等省少数民族地区，民间作为茶饮用植物已有上千年的应用历史〔6〕。研究表明，显齿蛇葡萄叶中主要次生代谢物以黄酮类化合物为主，含量达到45.52%〔7〕，其中以二氢杨梅素含量最高，是天然的抗氧化剂。现代药理研究表明，显齿蛇葡萄具有抗氧化，抑菌消炎，降血脂降血压和护肝效果〔8～11〕。民间常作为降血糖药物来治疗糖尿病，但是至今还没有相关报道，本研究观察显齿蛇葡萄的不同提取物体外和体内降血糖效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂 显齿蛇葡萄采集于信阳，经漯河医学高等专科学校李成宏老师鉴定为葡萄科蛇葡萄属藤本植物，凭证标本保存在漯河医专植物标本馆内。嫩叶在50℃～60℃烘干后用中药粉碎机粉碎过60目筛，备用。清洁级健康KM小白鼠，雄性体质量(20±2)g，由河南斯莱克竟达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCKK(豫)2009-0010，分笼饲养，饲料充足饮水不限，室温20℃～25℃，适应环境5 d后用于实验。阿卡波糖，α-葡萄糖苷酶，链脲佐菌素(STZ)均购自Sigma公司，盐酸二甲双胍购自重庆科瑞制药有限责任公司，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 AL104电子天平(Mettler-Toledo仪器公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；CTXNW-10B超声波循环提取机(北京弘祥生物技术开发公司)；Free Style 利舒坦雅培血糖仪(美国Abbott Diabetes Care公司)；DU-800紫外扫描分光光度计(美国贝克曼库尔特公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的提取 准确称取显齿蛇葡萄叶粉末2 000 g 5份，分别用20倍体积的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇浸泡24 h后，利用循环超声波提取仪提取45 min，减压浓缩回收得提取物，再经过冷冻干燥得到5个提取物，分别是正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)以及70%乙醇提取物(EE)。

1.3.2 总酚和总黄酮的含量以及对DPPH和ABTS清除率的测定 显齿蛇葡萄不同提取物中的总酚和总黄酮的含量测定参照文献〔12〕进行测定。另外，DPPH和ABTS自由基清除作用依照文献〔12〕方法进行测定，对DPPH清除时不同提取物的浓度为5～500 μg/ml，对ABTS清除时不同提取物的浓度为1～50 μg/ml，用BHT作为对照。

1.3.3 体外降血糖效果评价 参照参考文献〔9〕的测定方法，略作修改。分别取60 μl不同提取待测液(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/ml样品液、阿卡波糖溶液以及芦丁溶液，同量的缓冲液作为空白对照)于96孔酶标板中，加入50 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/ml)，振匀后于37℃水浴保温10 min，加入50 μl 5.0 mmol/L PNPG溶液振匀，在37℃水浴中反应20 min，加入160 μl Na2CO3溶液(0.2 mol/L)终止酶促反应，置于405 nm 波长处测吸光度(A)。由于显齿蛇葡萄提取物本身有颜色，因此每个样品需要测定背景吸收，并最终测定结果进行校正。每个样品重复3 次取平均值。抑制率(%)=(A0-AS)/A0 ×100%。式中：AS为样品组吸光度；A0为空白对照组吸光度。

1.3.4 显齿蛇葡萄提取物体内降血糖效果检测 100只KM小鼠禁食12 h后，注射STZ 150 mg/kg(用pH4.5的柠檬酸钠溶液配制成),72 h后，尾部动脉取血测定血糖含量，血糖含量>11.1 mmol/L为造模成功的小鼠〔12〕。

选取小鼠80只，随机分为8组，正常组(蒸馏水)，控制组，二甲双胍组(30 mg/kg体重)，以及显齿蛇葡萄不同提取物(200 mg/kg体重)剂量组，小鼠分笼饲养，每天按剂量给药1次，自由进食、饮水。实验周期4 w，在实验1、2、3、4 w末尾静脉采血，测空腹血糖。实验第4周末，乙醚麻醉小鼠后摘取眼眶取血，血样4℃3 500 r/min离心10 min后取血清用来测定血清胰岛素水平。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1 显齿蛇葡萄不同提取物中总酚和总黄酮含量以及对DPPH和ABTS清除率的测定 70%EE中的总酚和总黄酮含量均为最高，而其他提取物中的总酚和总黄酮含量是不同的，利用体外抗氧化实验如对DPPH和ABTS的清除效果评价提取物的活性，从IC50的只可以看出，70%EE对DPPH和ABTS具有明显的清除效果。其他提取物对DPPH和ABTS的清楚效果是根据总酚和总黄酮的含量呈正相关。总酚和总黄酮含量越高，清除效果越好，说明总酚和总黄酮是显齿蛇葡萄中的主要起作用的物质。见表1。

表1 显齿蛇葡萄中不同提取物总酚、总黄酮含量以及DPPH和ABTS的IC50值

与BHT比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 不同提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制 不同提取物中，EE对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最好，其次是ME，抑制效果最差的是HE，说明高含量的总酚类物质和总黄酮类物质的提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制具有较强的活性，另外每种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性随着剂量的增大，抑制活性随着增大，说明显齿蛇葡萄提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性是剂量依赖型的。比较不同质量浓度显齿蛇葡萄、阿卡波糖和芦丁对α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，随质量浓度增加，EE和ME对α-葡萄糖苷酶抑制活性好于芦丁，但低于阿卡波糖。见图1。

2.3 不同提取物体内降血糖效果研究 与正常组比较，STZ致糖尿病小鼠的血糖含量明显升高，经过4 w的治疗后，与控制组比较，经过不同提取物的治疗发现，各治疗组的糖尿病小鼠的血糖含量显著降低(P<0.01)，且EE-200 mg/kg剂量组小鼠的血糖含量与二甲双胍组小鼠的血糖含量在4 w后比较相近，结果说明显齿蛇葡萄具有较强的降血糖效果，并且体现为70% EE的降血糖效果最佳。见表2。

图1 不同提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果

组别0w1w2w3w4w正常组65±0576±0875±0668±0865±03控制组225±18248±08256±13176±14285±13二甲双胍组218±164179±042)168±132)159±141)87±142)HE组215±05206±031)196±182)195±051)175±112)CE组233±21225±15206±151)195±141)175±182)EAE组244±15228±13195±122)178±16149±212)ME组234±08218±11185±122)168±08135±142)EE组225±15205±071)165±112)135±062)89±142)

与控制组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 不同提取物对糖尿病小鼠血清胰岛素含量的影响 糖尿病小鼠血清中的胰岛素含量〔(21.4±2.7)mIU/L〕明显低于正常小鼠〔(51.2±3.5)mIU/L〕血清中的血清，说明经过STZ造模后，胰岛细胞遭到破坏，抑制胰岛素的分泌，经二甲双胍和不同提取物的4 w治疗，二甲双胍组〔(36.8±3.1)mIU/L〕小鼠中血清含量明显提高(P<0.01)，但是HE组〔(23.6±2.5)mIU/L〕和CE组〔(24.1±2.4)mIU/L〕小鼠血清中胰岛素的含量提高不大，说明这两个提取物对糖尿病小鼠治疗效果不明显，而EAE组〔(31.2±2.8)mIU/L〕、ME组〔(32.4±2.6)mIU/L〕和EE组〔(40.5±2.4)mIU/L〕小鼠血清中的胰岛素含量得到明显提高(P<0.01,P<0.05)，尤其是EE组小鼠血清中的胰岛素提高幅度较大，仅次于二甲双胍组中的含量。

3 讨 论

本文结果说明显齿蛇葡萄中主要活性物质是酚类物质和黄酮类物质，酚类物质和黄酮类物质成为当今研究热点，尤其在降血糖、抗氧化等方面取得了显著的成果〔13,14〕，本研究发现不同提取物中70%EE中的酚类物质和黄酮类物质含量最高，并且对DPPH和ABTS呈现了极高的清除效果。α-葡萄糖苷酶主要是催化淀粉(多糖)分解成单糖尤其是葡萄糖〔15〕。多种抑制剂如阿卡波糖和伏格列波糖都可以抑制α-葡萄糖苷酶，延缓双糖(淀粉在淀粉酶作用下水解为双糖)在α-葡萄糖苷酶作用下分解为单糖，延缓葡萄糖与果糖的吸收速度，从而降低餐后血糖，实验发现，不同提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果，但是EE的抑制效果最好，接近阿卡波糖的抑制效果，从而降低餐后的高血糖。糖尿病小鼠经过显齿蛇葡萄提取物4 w治疗后，小鼠中血糖含量明显减低，可能是显齿蛇葡萄提取物作为抗氧化剂防止胰腺β-细胞进一步受损的同时刺激受损胰腺β-细胞的修复和刺激胰腺β-细胞大量分泌胰岛素。另外，胰岛素的分泌能够刺激肝糖原的合成和抑制肝糖原磷酸化酶〔16〕，促进肝糖原的沉积，有利于血糖的降低。

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〔2015-07-05修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

张 斌(1980-)，女，讲师，主要从事中医学教学和研究。

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A

1005-9202(2017)02-0321-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.026