透明质酸对骨关节炎软骨细胞白细胞介素-1β及肿瘤坏死因子-α表达的影响

何 薇 赵 峰 张国平 王 辉 石 硕 裴宏磊

(河北医科大学第三医院手外科，河北 石家庄 050051)

透明质酸对骨关节炎软骨细胞白细胞介素-1β及肿瘤坏死因子-α表达的影响

何 薇 赵 峰1张国平1王 辉1石 硕1裴宏磊1

(河北医科大学第三医院手外科，河北 石家庄 050051)

目的 研究透明质酸(HA)对大鼠创伤性膝关节炎离体细胞模型白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法 体外分离、培养大鼠软骨细胞成功后，加入不同浓度的透明质酸钠，1 h后以10 μg/L的IL- 1β刺激，培养24 h后，通过免疫荧光检测软骨细胞膜ATP，IL-1β和TNF-α水平。结果 IL-1β组软骨细胞线粒体ATP丢失较正常软骨细胞显著升高；IL-1β和TNF-α水平在IL-1β组显著升高，与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。透明质酸钠干预IL-1β诱导的大鼠软骨细胞后，H20组和H40组的IL-1β及TNF-α水平明显低于IL-1β组(P<0.05)，而H10组中IL-1β及TNF-α水平与IL-1β组比较无统计学意义(P>0.05)。结论 透明质酸钠能够减少大鼠创伤性膝关节炎软骨细胞线粒体ATP的丢失，下调IL-1β和TNF-α水平。

透明质酸；软骨细胞；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α

骨关节炎(OA)主要是由于关节软骨退变诱发的。关节软骨是透明软骨，由于组织代谢活性低导致血液供应差，且软骨细胞分裂缓慢，通常不能修复〔1〕。透明质酸(HA)是一种自然软骨基质，从结构上讲是一种不含硫酸基的多聚糖，它的立体结构孔隙率高，增加其自身的表面积和空间，从而利于细胞在其中黏附并生长，同时还可以沉积大量的细胞外基质，为营养和气体进入及排出代谢产物提供便利，从而作为一种良好的材料与细胞接触〔2〕。目前HA上多用于治疗OA，疗效显著，副作用少。本研究为了验证HA与关节软骨细胞的组织相容性，分别在大鼠创伤性膝关节炎在体模型和离体细胞模型上验证HA对软骨细胞退变产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠12只，购自大连医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK(辽)2013-0006，体质量300～350 g，平均体质量(324.6±13.1)g，分笼饲养，自由饮食。随机均分为透明质酸钠组和空白对照组。

1.1.2 试剂 透明质酸钠由博士伦福瑞达制药有限公司提供。DMEM培养液和D′Hanks 液均由Gibco公司提供，胎牛血清由四季青公司提供，胰蛋白酶、胶原酶和白细胞介素(IL)-1β均购自Sigma公司。

1.1.3 材料和设备 24和96孔细胞培养板均由Gibco公司提供，Shel-Lable公司的CO2培养箱，超净工作台由无锡一净净化设备有限公司提供，倒置显微镜由日本Olympus公司提供，分光光度仪和Reder酶标仪购自日本。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠创伤性膝节炎模型的建立 腹腔注射0.5%戊巴比妥钠进行麻醉，将手术部位附近的毛减掉，并铺上消毒巾，在右膝内侧做一长约1 cm的切口，将皮肤及深筋膜切开，尽量使前交叉韧带和内侧半月板暴露在视野范围内，在切断前交叉韧带的同时，将半月板切除，之后按照顺序逐层缝合伤口。术后连续3 d注射青霉素钠，以预防感染，伤口缝合3 w后，于关节腔内注射透明质酸钠0.2 ml，空白对照组不注射任何药物。

1.2.2 大鼠软骨细胞的分离和培养 在关节腔中注射透明质酸钠治疗8 w后，在无菌条件下，取出SD大鼠的膝关节软骨。并使用刀片切成1 mm3大小的碎块，先后分别采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶将关节软骨的小碎块消化，得到软骨细胞悬液。在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中接种软骨细胞，在CO2培养箱中进行培养24 h，温度设置为37℃，细胞贴壁后，第2天换液。使用0.02%的EDTA冲洗铺满软骨细胞的瓶底，并使用0.25%胰蛋白酶进行消化处理，最后进行离心，收集其中的软骨细胞。

1.2.3 HA干预 将收集的软骨细胞按每孔20×105密度种于6 孔板，每孔加含培养液2 ml，置于饱和湿度5%CO2细胞培养箱中培养，温度设置为37℃、湿度设置为95%，各病例各种一板。48 h后根据细胞的贴壁情况决定是否更换培养液，待细胞80%汇合后，吸弃原培养液，分别加入含不同剂量HA的培养液2 ml，每个6孔板分为3组，每组2孔，分别为空白对照组、IL-1β组、IL-1β+10 mg/ml HA组(H10组)、IL-1β+20 mg/ml HA组(H20组)、IL-1β+40 mg/ml HA组(H40组)，培养24 h后，取上清，-20℃保存。

1.2.4 大鼠软骨细胞线粒体膜ATP观察 在软骨细胞培养基中加入不同浓度的透明质酸钠，培养2 h后加入10 ng/ml的IL-1β处理24 h。软骨细胞对照组中不加任何物质。以若丹明-123荧光染料处理对线粒体膜电位进行检测，荧光显微镜下观察。

1.2.5 IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α检测 将细胞培养上清液按相应ELISA试剂盒的说明进行操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0软件行LSD-t检验。

2 结 果

2.1 透明质酸钠对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞线粒体膜及细胞核形态的影响 IL-1β组软骨细胞的线粒体ATP的丢失较正常软骨细胞细胞显著升高；透明质酸钠可以显著逆转线粒体ATP的丢失，而且这种效应随透明质酸钠浓度的增加而愈加显著，见图1。

图1 透明质酸钠对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞线粒体膜ATP的影响(×200)

2.2 透明质酸钠对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞IL-1β及TNF-α表达的影响 IL-1β和TNF-α水平在IL-1β组中显著升高，与空白对照组比较，差异显著(P<0.05)。透明质酸钠干预IL-1β诱导的大鼠软骨细胞后，H20组和H40组的IL-1β及TNF-α水平明显低于IL-1β组(P<0.05)，而H10组中IL-1β及TNF-α水平与IL-1β组比较无统计学意义(P>0.05)，见表1。

指标空白对照组IL-1β组H10组H20组H40组IL-1β(pg/ml)1.68±0.2015.98±1.0651)15.68±1.259.248±0.912)5.67±0.942)TNF-α(pg/ml)1.53±0.1718.95±1.171)18.44±1.0712.48±0.9432)6.45±0.9872)

与空白对照组比较：1)P<0.05；与IL-1β组比较：2)P<0.05

3 讨 论

OA是一种慢性炎症性退行性疾患〔3〕，是临床常见的关节病，其病理基础是关节软骨的退变，也包括软骨的退变破坏，以及软骨、滑膜、肌腱、韧带等的综合性病变。常伴有关节疼痛、软骨退化，最终丧失正常的关节功能〔4,5〕。以非甾体类抗炎药为代表的药物治疗主要以控制症状和减轻疼痛为主。OA患者随着病情的进展，病情加重，初期病情较轻，但是晚期会出现例如关节肿痛等较严重临床症状，有甚者需要更换关节来延续生命〔6〕。HA是一种天然的非硫酸化黏多糖，在关节软骨、滑液、皮肤和房水中均存在，主要参与生物化学调节，不仅具有支持和润滑的作用，而且还可以维持关节的正常功能〔7,8〕。HA治疗OA的主要机制：①可以通过抑制组织疼痛感受器，阻断电信号的传导；②外界给予一定的HA可以诱导体内生成HA，从而提高HA在体内的浓度；③通过抑制金属基质蛋白酶而发挥抗炎作用。Joos等〔9〕于20世纪60年代首次提出黏弹性补充疗法的概念，通过向关节腔内注射大分子量的透明质酸钠溶液，不仅可以使得关节的黏弹性恢复，使得透明质酸钠重新对关节软骨起到保护作用，而且还可以降低滑膜炎症严重程度，恢复关节功能〔2〕。Wen〔10〕发现，无论是在体外或体内，透明质酸钠溶液和正常滑液能够明显抑制淋巴细胞和吞噬细胞的游走及转化，并减少炎症因子的释放量。临床应用透明质酸钠润滑关节、保护软骨、延缓关节炎发展取得了很好的疗效〔11〕。

正常的关节软骨光滑，富有弹性和耐磨特性，可以对关节产生传导载荷、吸收震荡、润滑关节的作用，从而维持关节的结构与功能稳定〔12〕。软骨细胞损伤后基质金属蛋白酶、IL-6及由巨噬细胞分泌IL-17等炎性因子释放，并积极参与关节软骨的退变进程〔13〕。IL-17促进滑膜细胞分泌IL-1β、TNF-α，后者也能促进IL-17的代谢，IL-17与IL-1β、TNF-α相互作用在加重滑膜炎症和关节软骨退变严重程度的同时，阻断软骨细胞增殖进程〔9〕，反过来这两种递质可破骨细胞活性，加速了创伤性关节炎的发展〔9,14〕。本研究结果提示透明质酸钠可以显著逆转线粒体ATP的丢失，同时能够显著下调大鼠软骨细胞IL-1β及TNF-α的水平，其下调效应依赖透明质酸钠的干预浓度。在OA的形成发展过程中，炎性因子的相互作用导致关节软骨破坏加速，并且提高促炎因子的合成与释放，加速巨噬细胞和白细胞在炎症部位的聚集，同时还降低其吞噬能力溶酶体酶的释放量，从而加速关节软骨的破坏。透明质酸钠可减轻和防止炎症反应，减少炎性因子对软骨的破坏，而且透明质酸钠的高孔隙率立体结构，使其具有更大的表面积，能够提供良好的材料-细胞作用界面，埋藏于细胞基质中，具有提高细胞间黏附性的作用，为软骨提供足够的营养，维持软骨的特性，润滑关节。 综上，透明质酸钠作为一种理想的液态修复材料，与关节软骨有较好的组织相容性，且操作简便，有望成为关节软骨修复的重要工具。

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4 Mobasheri A.The future of osteoarthritis therapeutics:emerging biological therapy〔J〕.Curr Rheumatol Rep,2013;15(12):385.

5 Mobasheri A.The future of osteoarthritis therapeutics:targeted pharmacological therapy〔J〕.Curr Rheumatol Rep,2013;15(10):364.

6 Fakhari A,Berkland C.Applications and emerging trends of hyaluronic acid in tissue engineering,as a dermal filler and in osteoarthritis treatment〔J〕.Acta Biomater,2013;9(7):7081-92.

7 Abate M,Verna S,Schiavone C,etal.Efficacy and safety profile of a compound composed of platelet-rich plasma and hyaluronic acid in the treatment for knee osteoarthritis(preliminary results)〔J〕.Eur J Orthop Surg Traumatol,2015;25(8):1321-6.

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13 Herrero-Beaumont G,Ivorra JA,Del CTM,etal.Glucosamine sulfate in the treatment of knee osteoarthritis symptoms:a randomized,double-blind,placebo-controlled study using acetaminophen as a side comparator〔J〕.Arthritis Rheum,2007;56(2):555-67.

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〔2015-03-30修回〕

(编辑 李相军)

河北省2015年度医学科学研究重点课题(No.20150640)

赵 峰(1978-)，男，硕士，副主任医师，主要从事关节损伤与修复方面的研究。

何 薇(1980-)，女，主治医师，主要从事手部关节损伤与修复方面的研究。

R68

A

1005-9202(2017)01-0025-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.010

1 河北医科大学第一医院骨科