丝胶对2型糖尿病大鼠海马Bad表达的影响

王芳芳 曹星华 高旭红 宋成军 陈志宏

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

丝胶对2型糖尿病大鼠海马Bad表达的影响

王芳芳 曹星华 高旭红1宋成军2陈志宏2

(承德医学院附属医院神经内科，河北 承德 067000)

目的 探讨丝胶(彩色蚕茧水提物)对2型糖尿病模型大鼠海马Bad表达的影响。方法 取健康雄性SD大鼠，以25 mg/kg的链脲佐菌素连续(1次/d，注射3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，模型成功建立后给予模型大鼠丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃35 d，同时以二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)作为阳性对照药物。分别采用蛋白印迹法和逆转录PCR法检测大鼠海马Bad蛋白和mRNA的表达情况。结果 与糖尿病模型大鼠比较，丝胶组大鼠海马Bad蛋白和mRNA的表达明显降低(P<0.05)。结论 丝胶可通过下调糖尿病模型大鼠海马Bad的表达，减弱Bad的促凋亡作用，这可能是丝胶保护糖尿病海马损伤的机制之一。

丝胶；2型糖尿病；Bad；凋亡

研究发现，2型糖尿病(T2DM)模型鼠学习记忆能力明显减退〔1〕。学习记忆能力明显减退的糖尿病模型大鼠，海马CA1区神经细胞出现了明显的凋亡，因此提示糖尿病海马损伤导致的认知功能障碍可能与神经细胞凋亡有关〔2,3〕。前凋亡因子Bad作为凋亡调节蛋白家族——Bcl-2家族成员之一，是蛋白激酶B(PKB/Akt)信号通路重要的下游组分，参与细胞分化、增殖和凋亡等活动，尤其重要的是对细胞凋亡的调节作用〔4,5〕。本研究拟探讨彩色蚕茧水提物丝胶改善糖尿病大鼠海马损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性清洁级SD大鼠48只，河北医科大学实验动物学部，合格证号：712024。链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma，2%，用柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.4)临用时配制；BCA蛋白定量试剂盒、Super ECL Plus超敏发光液、DNA Ladder，北京泰格美科技有限公司；小鼠抗Bad多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；即用型HRP标记山羊抗小鼠IgG，美国KPL公司；Trizol，美国Invitrogen公司；Bad引物，上海生工生物工程技术服务有限公司；RT-PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司。丝胶，彩色蚕茧(承德医学院蚕业研究所提供)蒸馏水浸泡24 h后水煎2次，合并滤液后过滤、浓缩，即得。

1.2 分组与给药 48只SD大鼠随机分为空白对照组(BC组)、糖尿病模型组(DM组)、丝胶治疗组(ST组)和二甲双胍阳性对照组(MPC组)，每组12只。采用STZ，(25 mg/kg，1次/d，连续注射3 d)腹腔注射法建立T2DM大鼠模型，成模标准是注射STZ 7 d后大鼠的空腹血糖≥16.7 mmol/L。成功建立糖尿病模型后，DM组大鼠不再做任何处理，ST组和MPC组大鼠分别给予丝胶(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲双胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃治疗35 d。

1.3 标本制备 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦于眶后静脉丛采取静脉血，4℃、3 000 r/min离心后去血清，使用全自动生化分析仪采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。大鼠取血后断头处死，迅速取脑于冰盘上分离双侧海马入液氮保存。

1.4 海马Bad表达的检测

1.4.1 蛋白印迹法检测海马Bad蛋白的表达 以BCA蛋白试剂盒定量大鼠海马的蛋白浓度。取100 μg海马蛋白质上样，15% SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，Bad(1∶200)和β-actin(1∶1 000)一抗室温摇床孵育，super ECL Plus超敏发光液显影，胶片扫描。采用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以Bad条带灰度/β-actin条带灰度作为Bad蛋白的相对表达水平。

1.4.2 逆转录PCR法检测海马Bad mRNA的表达 提取海马总RNA逆转录为cDNA，进行PCR反应。反应条件：94℃、2 min，94℃、30 s，50～65℃、30 s，72℃，1 min，第2步起循环。引物序列：①Bad，正义:5′-GGCGCTTTGTCGCATCTGTG-3′，反义:5′-TCCTTCTCCTTTGCAGCTTCC-3′；②β-actin，正义:5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反义:5′-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。退火温度：Bad 60℃、β-actin 29℃，循环次数：Bad 31次，β-actin 29次，产物大小：Bad 396 bp、β-actin 445 bp。取5 μl扩增产物和5 μl DNA Ladder进行2%琼脂糖凝胶电泳，用ZF型紫外透射反射分析仪摄像。应用Quantity One-4.6.2软件进行定量分析，以Bad条带光密度/β-actin条带光密度作为Bad mRNA表达的相对水平。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 血糖水平检测结果 与BC组比较，DM组血糖水平明显升高(P<0.05)；与DM组大鼠比较，ST组、MPC组血糖水平明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2 海马Bad表达检测结果 与BC组比较，DM组海马Bad的表达明显升高(P<0.05)；与DM组比较，ST组、MPC组海马Bad的表达明显降低(P<0.05)。见图1，图2，表1。

图1 蛋白印迹法检测大鼠海马Bad蛋白的表达

图2 逆转录PCR法检测大鼠海马mRNA的表达

组别血糖(mmol/L)Bad蛋白mRNABC组10.83±2.031)0.3382±0.01391)0.3032±0.01471)DM组29.45±4.820.9485±0.02511.3525±0.0339ST组13.20±4.091)0.5280±0.01751)0.5423±0.01261)MPC组13.18±2.301)0.5269±0.01961)0.6205±0.01021)

与DM组比较：1)P<0.05

3 讨 论

细胞凋亡过程中能保持细胞膜的完整性，不产生炎症反应〔6〕。Bad可与Bcl-2和(或)Bcl-xL结合形成异源二聚体，减弱Bcl-2和Bcl-xL的抑凋亡作用，从而促进细胞凋亡〔7〕。当细胞受到凋亡信号刺激时，Bad的构象发生改变，从而改变其在线粒体的位置，在线粒体形成Ca2+内流和Cyto C外流的交换通道，启动线粒体凋亡途径〔8〕。本研究进一步证实糖尿病引起海马损伤与神经细胞凋亡有关，进而可导致学习记忆能力下降。根据民间蚕茧泡水降血糖的验方，结合《本草纲目》关于蚕茧的记载：蚕茧，性甘、温，无毒，具有滋阴润燥、生精止渴的作用〔9〕，本课题组采用水煎的方法提取蚕茧中的水溶性蛋白——丝胶，前期研究发现，丝胶能明显降低DM模型大鼠的血糖并改善DM大鼠肝脏损伤〔10,11〕。本研究结果显示，丝胶可通过下调DM模型大鼠海马Bad的表达，减弱Bad的促凋亡作用，这可能是丝胶减少海马神经细胞凋亡、保护DM海马损伤的机制之一。目前，临床治疗DM仍以服用化学合成的药物为主(如二甲双胍等)，各种药物虽能明显降低血糖，但不能有效改善胰岛素抵抗，长期服用容易产生比较严重的副作用，造成肝、肾损害〔12〕。丝胶约占蚕茧的25%～30%，在提取丝素(用于制作衣料)的过程中被丢弃，不但浪费了丝胶也造成了环境污染。本课题组将深入探讨丝胶对DM并发多脏器损伤的作用，一方面为临床治疗DM及其并发症提供新思路，另一方面也有利于蚕桑资源的开发。

1 郭俊楠，张俊士，贺维亚，等.阿尔茨海默病合并2型糖尿病与海马损伤——从应激反应到自噬产生〔J〕.中华神经科杂志，2015;48(7):556-63.

2 Wang H,Chen F,Zhong KL,etal.PPARγ agonists regulate bidirectional transport of amyloid-β across the blood-brain barrier and hippocampus plasticity in db/db mice〔J〕.Br J Pharmacol,2016;173(2):372-85.

3 张栋珉，肖 谦，张 颖.血管紧张素Ⅳ对糖尿病大鼠海马神经元凋亡及其认知功能的影响〔J〕.重庆医科大学学报，2010;35(7):978-81.

4 Ghorbani A,Jeddi-Tehrani M,Saidpour A,etal.PI3K/AKT and Mdm2 activation are associated with inhibitory effect of cAMP increasing agents on DNA damage-induced cell death in human pre-B NALM-6 cells〔J〕.Arch Biochem Biophys,2015;566:58-66.

5 Prasad S,Madan E,Nigam N,etal.Induction of apoptosis by lupeol in human epidermoid carcinoma A431 cells through regulation of mitochondrial,Akt/PKB and NFkappaB signaling pathways〔J〕.Cancer Biol Ther,2009;8(17):1632-9.

6 Fiers W,Beyaert R,Declercq W,etal.More than one way to die:apoptosis,necrosis and reactive oxygen damage〔J〕.Oncogene,1999;18(54):7719-30.

7 Yao Y,Dou C,Lu Z,etal.MACC1 suppresses cell apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting the HGF/c-MET/AKT pathway〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;35(3):983-96.

8 何家璇.Bad蛋白对细胞凋亡的调控作用〔J〕.医学综述，2007;13(3):161-3.

9 李时珍.本草纲目〔M〕.北京：人民卫生出版社，1985：1045-52.

10 付秀美，钟美蓉，付文亮，等.丝胶对2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(1):103-5.

11 侯丽娜，陈 程，刘东慧，等.丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子-4α表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(4):20140-2.

12 Gambaro V,Dell′acqua L,Farè F,etal.A case of fatal intoxication from metformin〔J〕.J Forensic Sci,2007;52(4):988-91.

〔2016-02-15修回〕

(编辑 郭 菁)

Effects of sericin on Bad expression in hippocampus of type 2 diabetic rats

WANG Fang-Fang, CAO Xing-Hua, GAO Xu-Hong,et al.

Department of Neurology, Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei, China

Objective To investigate the effects of sericin (water extracts of color silkworm cocoon) on Bad expression in hippocampus of type 2 diabetic rats.Methods Healthy male SD rats were used to establish type 2 diabetes rats model by intraperitoneally injecting streptozotocin (25 mg/kg, 1 time a day, 3 days). Then the model rats were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) for 35 days. The metformin (55.33 mg·kg-1·d-1) was used as positive control drug at the same time. Western blot and RT-PCR were used to detect the expressions of Bad protein and mRNA in hippocampus.Results Compared with those of type 2 diabetes model rats, the expressions of Bad protein and mRNA in hippocampus of rats using sericin were declined obviously (P<0.05).Conclusions Sericin could weaken the role of Bad in promoting apoptosis by down-regulation the Bad expression in hippocampus; this maybe one of the mechanisms that sericin protecting hippocampus injury during diabetes.

Sericin;Type 2 diabetes mellitus;Bad;Apoptosis

国家自然科学基金项目(81441133)；河北省自然科学基金项目(H2012406018)；河北省高校重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助

陈志宏(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治研究。 宋成军(1972-)，男，硕士，研究员，硕士生导师，主要从事糖尿病及其并发症的中医药防治研究。

王芳芳(1964-)，女，主要从事神经内科方面的研究。

R587

A

1005-9202(2017)01-0007-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.003

1 承德医学院附属医院泌尿外科 2 承德医学院人体解剖学教研室