枯草杆菌二联活菌对溃疡性结肠炎大鼠的作用及机制

梁 勇 颜丽萍 苏 林 李 弘 闫玉栋

(桂林市第二人民医院消化内科，广西 桂林 541000)

枯草杆菌二联活菌对溃疡性结肠炎大鼠的作用及机制

梁 勇 颜丽萍 苏 林 李 弘 闫玉栋

(桂林市第二人民医院消化内科，广西 桂林 541000)

目的 探讨枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊(美常安)对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠促炎症性细胞因子白细胞介素(IL)-1β和细胞黏附分子CD44表达的影响及其作用机制。方法 采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法灌肠建立UC大鼠模型。将SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、美常安治疗组。观察各组疾病活动指数(DAI)、结肠组织病理学评分(HPS)。造模及美常安干预7 d后处死大鼠，取结肠行HE染色，观察镜下结肠病理变化。RT-PCR 法检测各组大鼠肠黏膜细胞因子IL-1β mRNA表达，流式细胞仪检测各组大鼠结肠组织中黏附分子CD44的含量。结果 模型组较正常对照组大鼠结肠黏膜可见脓性分泌物、糜烂及溃疡，美常安干预后显著改善UC大鼠结肠黏膜的病理变化，DAI和HPS评分下降显著，并明显降低UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表达(P<0.05)。结论 枯草杆菌二联活菌可能通过下调UC大鼠IL-1β mRNA和CD44的表达而发挥干预作用。

溃疡性结肠炎；枯草杆菌二联活菌(美常安)；白细胞介素-1β；黏附因子CD44

溃疡性结肠炎(UC)作为肠道炎症性疾病其病因和发病机制尚不明确，病变主要始于左侧结肠，以连续方式向结肠近端乃至全结肠逐渐发展，临床主要表现为腹泻、腹痛和黏液脓血便〔1〕。研究指出，细胞因子和黏附分子与UC的发病息息相关，可作为检测UC发展程度的重要指标〔2〕。同时有研究报道，UC的发生与肠道菌群具有显著相关性〔3〕。虽然枯草杆菌二联活菌治疗UC的疗效已得到充分肯定，但机制并未完全阐明。本研究采用枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊(美常安)治疗UC大鼠，检测肠黏膜组织中细胞因子白细胞介素(IL)-1β和黏附分子CD44的变化，旨在从细胞水平探讨枯草杆菌二联活菌对UC的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 美肠安购于北京韩美药品有限公司，主要成分为枯草杆菌和粪肠球菌；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；RT-PCR仪器及其相关酶和缓冲液(美国Roche公司)。

1.2 药物剂量 将1粒美肠安胶囊去壳后用16 ml生理盐水溶解，配成溶液用于后续试验。

1.3 动物模型的制备与分组 用经典的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法制作模型，造模结束后，挑取5只大鼠处死，当观察到结肠黏膜充血水肿后，对其作病理切片，验证结肠黏模发生损伤、糜烂，说明造模成功。将SD大鼠随机分成正常对照组20只，其余40只大鼠按上述方法造模，证造模成功后，第20天开始将造模成功的大鼠随机分为模型组(n=18)和美常安治疗组(n=17)。正常对照组大鼠以2 ml生理盐水灌肠，其余两组用5%乙酸1.0 ml灌肠。2 d后，正常对照组和模型组每日用生理盐水2 ml灌胃；美常安治疗组用美常安溶液2.5 ml灌胃1次/d，12.5 g/kg；7 d后禁食24 h，处死大鼠，剖开腹部，于病变最严重的部位剪取约1 cm的结肠组织，剖开，固定于10%甲醛溶液中，分别采用80%、90%、95%、100% 乙醇进行梯度洗脱，加入二甲苯进行透明处理后，进行石蜡包埋切片。

1.4 结肠组织中黏附分子CD44含量测定 UC大鼠取病变组织1 cm置于0.9%生理盐水中，-25℃冰箱保存备用。取出解冻，将盐水冲洗干净的结肠组织使用匀浆组织破碎仪粉碎至匀浆状。接着加入20 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，用枪打散匀浆后，先以100目尼龙网过滤到洁净EP管内。2 500 r/min离心沉淀3～5 min，再用PBS冲洗3次，3次低速离心(500～800 r/min)去除细胞碎片，然后用30目尼龙网将絮状团块过滤掉，获得澄澈细胞悬液。采用流式细胞术，严格按照规定的操作方法和步骤检测CD44含量。

1.5 RT-PCR检测结肠组织中IL-1β mRNA的表达 采用mRNA提取试剂盒提取细胞中的总mRNA，储存于-80℃低温冰箱。取总mRNA，利用RT-PCR将其反转录为cDNA。通过基因库查询出IL-1β的引物序列：上游5′-ACC TTCCAGGATGAGGACATGA-3′，下游5′-GATTCTTTCCTTTGAGGCCCA-3′。采用经典的PCR技术行基因扩增，检测各组IL-1β mRNA相对含量。

1.6 症状和体征观察及评分 造模过程中，每天定时观察各组小鼠的体重变化、大便状态以及便血情况，参照Cooper的经典评分系统，根据每组小鼠各种症状和体征变化进行评分计算，作为DAI。

1.7 结肠组织病理学评分(HPS) 选取距肛门2.0 cm以上的结肠100倍显微镜下观察。根据炎症和溃疡对结肠黏膜损伤情况进行大致评分。溃疡形成及炎症：无症状为0分，轻微充血无溃疡形成为1分，轻微溃疡为2分，溃疡合并炎症为3分，严重溃疡合并炎症为4分，5分是>2处溃疡和炎症>1 cm，6～8分为溃疡和炎症>2 cm。留取结肠标本分别用于苏木素-伊红(HE)染色。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行分析行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠DAI评分情况 UC模型组大鼠开始出现逐渐加重的黏液状稀便；饲养1 d后，大便次数开始增多，发现大便末端有黏液或脓点等现象；造模3 d后，大鼠的粪便全部变成了稀便，有部分大鼠出现便中带血；5 d左右模型大鼠饮食明显减少，体重下降显著，精神萎靡。正常对照组大鼠大便、体重、毛发光泽度和活力等均正常。美常安治疗组大鼠与模型组同期相比，食欲不振、便血和毛发干枯等症状都有不同程度的缓解。造模第7天。模型组的DAI(6.80±2.33)明显高于对照组(0.38±0.14)，而美常安干预后DAI明显缓解(4.13±1.80)。

图1 各组大鼠结肠黏膜病理表现(HE，×100)

2.2 各组大鼠HPS评分情况 见图1。显微镜下，模型组大鼠结肠黏膜损伤明显，黏膜充血水肿清晰可见，溃疡和炎症范围扩大，黏膜糜烂和脓肿形成，腺管排列紊乱，HPS评分(3.54±0.35)分明显高于对照组(0.66±0.79)(P<0.05)。美常安干预后，HPS评分(1.05±0.49)较模型组下降明显。

2.3 各组结肠组织中IL-1β mRNA及CD44表达比较 与正常对照组(0.04±0.02，8.64±1.81)相比，模型组IL-1β(0.24±0.06)和CD44(14.74±1.41)的表达明显升高(P<0.05)，而美常安干预后两者表达量下降显著(0.07±0.03，10.23±1.37，P<0.05)。

3 讨 论

细菌在肠道炎症发生发展中起到了极为关键的作用。有文献报道，结肠的微生物浓集区域恰好是UC患者发生炎症常见的部位〔4〕。因此，肠道共生菌群的作用逐渐引起大家重视并在此方面寻求突破，设想以枯草杆菌二联球菌为代表的益生菌及其产物治疗UC的策略顺势而生。

IL-1β是一种主要由单核细胞产生的具有多种生物活性并能作用于体内多种组织和器官的多肽类细胞因子，在炎症和免疫应答中发挥关键作用，是UC 发病的重要原因之一〔5〕，因其可趋化炎症因子进入结肠组织，引起肠道部位发生诸如结肠上皮组织损伤、小血管炎、隐窝脓肿等的病变，还能反馈性地促进淋巴细胞产生IL-2等进而加速炎症进程，协同促进炎症反应，最终造成UC的发病〔6〕。有文献报道从UC患者结肠黏膜中检测到吞噬细胞中IL-1β表达异常升高，且与临床症状严重程度基本一致〔7〕。

细胞黏附分子作为一类位于细胞膜表面的糖蛋白分子，其与UC的关系同样引起大家的重视。它能介导细胞黏附、趋化淋巴细胞归巢等参与炎症和免疫反应〔8〕。细胞表面黏附分子CD44又被称为吞噬细胞膜糖蛋白，在淋巴细胞成熟和归巢过程中起重要作用，并在正常淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞中均有表达，在内皮细胞弱表达，但在结肠及上皮细胞中不表达〔9〕。有研究报道，在正常生理情况下，炎症反应开始时伴随CD44表达的升高，炎症细胞与靶细胞黏附增加，而当炎症反应结束后，二者黏附性随即减弱，使损伤的组织逐渐恢复正常〔10〕。然而当发生溃疡性结肠炎时，CD44的表达不随炎症反应结束而减少，导致炎症细胞与靶细胞的黏附无法正常终止，炎症消退减慢或炎症的持续存在，最终表现为持续的组织损伤〔11〕。

美常安是含有枯草杆菌和粪肠球菌的益生菌制剂，具有显著的生物夺氧功能。枯草杆菌能够暂时定植于肠内部位，降低局部组织的氧浓度和氧还原电位，营造出适合厌氧的正常肠道优势菌群生长的环境。粪肠球菌与枯草杆菌的结合可使前者在消化系统的存活率显著提高，进而发挥最大的生物学效应〔12〕。本研究说明美常安干预显著改善了UC模型大鼠的临床症状和结肠炎症反应，效果显著。RT-PCR和流式细胞术检测结果提示，在UC发病机制中可能是促炎因子IL-1β表达增多、作用增强,再加上黏附分子CD44的活性持续存在，二者协同产生一个异常的免疫应答反应,最终导致UC发病。IL-1β和CD44很可能是发病机制中的关键环节，美肠安通过提高肠道减少的有益菌群，增强肠道黏膜屏障，抑制肠黏膜中促炎因子IL-1β和黏附分子CD44的表达,从而减轻肠黏膜的炎症反应，起到治疗UC的作用。

1 党惠娇,蔡少华,张在厚,等.中药灌肠联合美沙拉嗪对溃疡性结肠炎患者血小板功能的影响〔J〕.现代生物医学进展,2015;15(22):4314-6.

2 Wang S,Zhou T,Zhai JP,etal.ffects of modified Sanhuang decoction enema on serum tumor necrosis factor-alpha and colonic mucosa interleukin-1β,interleukin-6 levels in ulcerative colitis rats〔J〕.Chin J Integr Med,2014;20(11):865-9.

3 AbdElazeem MA,M El-Sayed M.The pattern of CD44 and matrix metalloproteinase 9 expression is a useful predictor of ulcerative colitis-associated dysplasia and neoplasia〔J〕.Ann Diagn Pathol,2015;19(6):369-74.

4 张利利,赵英政,常廷民,等.枯草杆菌二联活菌胶囊对溃疡性结肠炎患者Th17/Treg细胞表达的影响〔J〕.广东医学,2014;35(3):448-50.

5 姜小龙.美沙拉嗪与枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊联用治疗溃疡性结肠炎疗效探讨〔J〕.中国药物与临床,2013;13(3):386-7.

6 张继乔.美沙拉嗪联合益生菌制剂(枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊)在溃疡性结肠炎治疗中的应用〔J〕.医学信息,2014;27(32):253.

7 王 雪,颜 玉,任秀英,等.益生菌对溃疡性结肠炎大鼠IL-1β、CD44的作用〔J〕.黑龙江医药科学,2014;37(5):24-5,28.

8 王 燕,曹燕飞,朱向东,等.四神丸对溃疡性结肠炎模型大鼠血清白细胞介素-1β、-4、肿瘤坏死因子-α的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(1):127-9.

9 张 歆,柯 晓,陈锦团,等.IL-1β、IL-4在湿热证溃疡性结肠炎大鼠模型中的动态表达及意义〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2015;36(5):697-701.

10 Shen J,Zuo ZX,Mao AP,etal.Effect of probiotics on inducing remission and maintaining therapy in ulcerative colitis,Crohn′s disease,and pouchitis:meta-analysis of randomized controlled trials〔J〕.Inflamm Bowel Dis,2014;20(1):21-35.

11 郭 虹,曹 蕾,王瑞芳,等.溃疡性结肠炎患者血清 IL-1β和IL-18的表达和临床意义〔J〕.中国急救医学,2015;35(z1):45-6.

12 刘 翔,曾柳苑,林 虹,等.AIF-1及IL-1β在溃疡性结肠炎小鼠体内表达的研究〔J〕.海南医学,2015;26(21):3124-6.

〔2016-04-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(No.Z2014269)

梁 勇(1968-)，男，副主任医师，主要从事消化系统疾病研究。

R57

A

1005-9202(2017)01-0027-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.011