丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性活动的影响

吕 冰 邱德来 初春平 金 日 金文哲

(延边大学附属医院疼痛科，吉林 延吉 133000)

丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性活动的影响

吕 冰 邱德来1初春平1金 日2金文哲

(延边大学附属医院疼痛科，吉林 延吉 133000)

目的 探讨丙泊酚对在体小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发性单纯性放电活动、自发性复杂峰电位放电特性的影响。方法 选用6～8周龄ICR小鼠6只，腹腔注射乌拉坦麻醉，在小脑CrusⅡ小叶行开颅手术，开孔直径为1.0～1.5 mm，去除硬脑膜后，用蠕动泵在脑表面持续灌流含氧的人工脑脊液，浦肯野细胞贴附式记录使用Multi clamp700B膜片钳放大器，通过D/A转换器1440和Clampfit 10.3软件获取浦肯野细胞自发性活动数据。待自发性活动记录稳定后，给予丙泊酚，观察其对浦肯野细胞自发性单纯峰电位(SS)和复杂峰电位(CS)活动的影响。结果 脑表面给予丙泊酚剂量依存地抑制小鼠小脑浦肯野细胞自发性SS放电活动，其半数抑制浓度为143 μmol/L，当浓度为500 μmol/L时自发性SS放电完全抑制，然而，丙泊酚对自发性复杂峰电位放电频率和波形特征无显著影响。结论 在体条件下，脑表面灌流丙泊酚显著抑制浦肯野细胞自发性SS放电活动。

丙泊酚；浦肯野细胞；小脑皮层；细胞贴附式记录

丙泊酚由于起效快、清除迅速和不良反应少等优点被广泛应用于全麻诱导与维持、重症监护室(ICU)患者镇静、无痛胃肠镜及无痛人流手术中。离体和在体实验均表明丙泊酚可通过活化γ-氨基丁酸(GABA)A型受体(GABAA)和甘氨酸受体对脊髓、海马和下丘脑神经元的活动产生抑制作用；然而，丙泊酚对在体动物小脑皮层神经元活动的影响报道极少。本实验拟应用细胞吸附式技术手段，在活体动物上观察丙泊酚的摄入对小鼠小脑皮层浦肯野细胞(PC)自发性活动的影响。

1 材料与方法

1.1 动物选择和主要试剂 选用6～8周龄健康雄性ICR小鼠6只，体重28～32 g，由延边大学实验动物中心提供。丙泊酚(批号：16IF1533)。人工脑脊液(ACSF)由以下成分组成(mmol/L):125 NaCl，3 KCl，1 MgSO4,2 CaCl2，1 NaH2PO4，25 NaHCO3，10 D-glucose。ACSF的渗透压为290～300 MOSM，pH 7.2～7.4。

1.2 主要仪器 美国产Multi clamp700B膜片钳放大器、1440AD/DA转换器、日本Nikon公司产膜片钳专用显微镜、美国Sutter公司生产的电动微操纵器(MP 385和MP 285)、微量喷射器(Picospritzer Ⅲ，美国)、德国莱卡公司生产的DM5500B显微镜、法国产Minipuls3蠕动泵、日本精密牙科钻及电极拉制仪等。

1.3 动物模型的制备 小鼠腹腔注射乌拉坦麻醉后固定在自制的脑定位仪上，通过加热垫使麻醉小鼠的体温稳定在(37.0±0.2)℃。在小脑手术部位周围制作一个防漏水记录槽后实施开颅手术〔直径(1.0±1.5)mm〕，除去硬脑膜后暴露出小脑皮层CrusⅡ部位进行电生理记录。手术暴露脑表面部位用蠕动泵持续灌流给予人工脑脊液(ACSF)，待自发性活动记录稳定后，给予丙泊酚。

1.4 PC放电记录 使用自动拉制仪将细玻璃管拉制成记录电极，填充20～30 μl ACSF，将记录电极安装于电动微操作器上，通过显微镜观测电极移动，在显微镜下确定记录部位后，将记录电极准确置于记录区域。PC贴附式记录使用Multi clamp700B放大器，通过D/A转换器1440和Clampfit10.3软件获取PC自发性活动数据。记录电极内填充ACSF，填充后阻抗为3～5 MΩ。在细胞贴附式记录条件下，PC是通过其独特的单纯和复杂放电模式认定的。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行配对t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1 高浓度丙泊酚对小脑PCs自发性简单峰电位和复杂峰电位放电率的影响 在细胞贴附式记录模式下，通过自发性规律简单峰电位(SS)和不规律复杂峰电位(CS)的放电特征，共有22个神经元被认定为PC。小脑表面给予丙泊酚(500 μmol/L)完全抑制自发性单纯性放电，PC自发性SS放电频率较给药前相比降低了99.5%，但对自发性复杂峰电位放电频率无显著影响。见图1。

A，给予ACSF(上面)和500 μmol/L丙泊酚(下面)记录的PCs的SS；1)表示复杂峰电位；B，500 μmol/L丙泊酚诱导的PCs单纯性放电频率变化的时间过程；C，500 μmol/L丙泊酚诱发PCs单纯性放电频率变化的时间过程统计图图1 高浓度丙泊酚对小脑PCs自发性简单峰电位和复杂峰电位放电率的影响

2.2 丙泊酚对PCs自发性SS抑制作用的剂量依存关系丙泊酚对小鼠小脑PCs自发性SS活动的抑制具有剂量依存性，可引起PCs自发性SS放电显著抑制的最小浓度为10 μmol/L，其抑制程度可达3%左右；半数有效抑制浓度为143 μmol/L，500 μmol/L的丙泊酚已经达到最大抑制浓度。见图2。

2.3 丙泊酚对PCs自发性复杂峰电位特征的影响 虽然丙泊酚对PC自发性SS放电明显抑制，但不影响CS自发性活动。进一步分析发现，在丙泊酚存在条件下CS自发性活动频率为0.53 Hz，与给药前(0.46 Hz)相比无显著差异(P>0.05)。而CS放电小穗平均数量为3.3 个，与给药前(3.3 个)比较也无显著差异(P>0.05)。见图3。

图2 丙泊酚对PCs自发性SS抑制作用的剂量依存关系

图3 丙泊酚对PCs自发性复杂峰电位特征的影响

3 讨 论

小脑皮层主要通过苔状纤维(MF)和爬行纤维(CF)传入外部信息，参与精细运动调节和运动学习。一般认为，经MF传入的感觉信息通过颗粒细胞的轴突-平行纤维途径间接地兴奋PC，表现为简单峰电位(simple spike)，而经CF传入的感觉信息可兴奋PC，表现为复杂峰电位(complex spikes)〔1〕。MLI是PC的抑制性中间神经元，分为篮状细胞(BC)和星状细胞(SC)。BC的轴突末梢包裹在PC的胞体和轴突起始段，其兴奋可使PC产生迅速而强烈的环胞体抑制，直接影响PC峰电位的输出；而SC的轴突选择性地与PC树突形成抑制性突触联系，SC兴奋可对PC树突产生抑制，分流平行纤维的兴奋性传入，平衡PC树突的兴奋性〔2〕。Chu等〔3～5〕发现感觉刺激不能兴奋PC，反而兴奋MLIs，导致 PC产生抑制、单纯性放电暂停。

静脉麻醉药对神经系统功能影响机制的研究方法分为离体脑片记录和在体记录两大类。脑片标本保持了部分在体情况下的神经通路，并且易于施加药物和观察药物的直接作用，但是脑片的制备过程比较复杂，且不可避免地损伤复杂的神经网络，因此脑片仅是对生理条件的近似模拟。在体电生理记录的优势在于能真实地反映生理状态下神经突触传递的情况，能够在整体条件下观察神经突触活动的变化，利于从宏观角度研究和探讨静脉麻醉药物的作用机理。

Jin等〔6〕在体研究小鼠小脑表面给予丙泊酚 (10～1 000 μmol/L)剂量-依存性地抑制PCs SS频率，半数有效浓度为144.5 μmol/L。大剂量完全抑制PCs自发性SS，但对CS放电频率和波形特征无显著影响。最近研究发现，小鼠在体小脑表面灌流丙泊酚(10～1 000 μmol/L)显著降低感觉刺激诱发抑制GABA能突触传递反应的振幅和波形下面积，但明显增加该反应波形的上升时间与延迟时间。

脑表面灌流丙泊酚可显著增加感觉刺激诱发兴奋性反应的振幅和波形下面积，同时也增加该反应的上升时间和延迟时间。丙泊酚对小脑皮层感觉信息传递的影响可以被GABAA受体阻断剂阻断。上述结果表明丙泊酚通过调控成年小鼠GABAA受体活化影响感觉信息在小脑皮层分子层神经元网络中传递的动力学特征〔7〕。另有研究表明，丙泊酚通过活化N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)受体显著增强小鼠面部感觉刺激诱发的颗粒细胞层场电位反应，但丙泊酚对颗粒细胞层感觉刺激诱发场电位的增强作用与GABAA受体活化无关，进一步揭示了丙泊酚导致面部感觉刺激诱发小脑分子层和PC平行纤维兴奋性传入的增强机制〔8〕。本实验结果表明，在体条件下，脑表面灌流丙泊酚显著抑制浦肯野细胞自发性SS放电活动。在以后的研究中，有必要进一步深入研究丙泊酚对小脑神经元环路、感觉信息传递及突触可塑性的影响机制。

1 韩济生.神经科学〔M〕.第3版.北京：北京大学医学出版社,2008:796-818.

2 Santamaria F，Tripp PG，Bower JM.Feedforward inhibition controls the spread of granule cell-induced Purkinje cell activity in the cerebellar cortex〔J〕.J Neurophysiol，2007;97(1)：248-63.

3 Chu CP，Bing YH，Qiu DL.Sensory stimulus evokes inhibition rather than excitation in cerebellar Purkinje cells in vivo in mice〔J〕.Neurosci Lett,2011;487(2):182-6.

4 Chu CP，Bing YH，Liu QR，etal.Synaptic responses evoked by tactile stimuli in purkinje cells in mouse cerebellar cortex crus Ⅱ in vivo〔J〕.PLoS One，2011;6(7)：e22752.

5 Chu CP，Bing YH，Liu H，etal.Roles of molecular layer interneurons in sensory information processing in mouse cerebellar cortex crus Ⅱ〔J〕.PLoS One，2012;7(5)：e37031.

6 Jin R，Liu H，Jin WZ，etal.Propofol depresses cerebellar Purkinje cell activity via activation of GABAA and glycine receptors in vivo in mice〔J〕.Eur J Pharmacol，2015;764(1):87-93.

7 Jin WZ，Shi JD，Lin H，etal.Effects of propofol on the dynamic properties of sensory information processing in the mouse cerebellar cortical molecular layer in vivo〔J〕.Pharmacology，2015;96(5-6):271-7.

8 Jin WZ，Liu H，Wan P，etal.Propofol enhances facial stimulation-evoked responses in the cerebellar granule cell layer via activation of NMDA receptor in mice in vivo 〔J〕.Eur J Pharmacol，2016;788(1):37-44.

〔2015-12-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金(81560194)；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目(吉教科合字2016第267号)；延边大学科技发展计划项目(延大科合字2014第38号)

金 日(1975-)，男，博士，硕士生导师，主要从事运动损伤和关节外科的诊疗。 金文哲(1971-)，男，博士，硕士生导师，主要从事静脉麻醉药影响小脑皮层功能方面的研究。

吕 冰(1991-)，男，硕士，主要从事神经病理性疼痛电生理机制的研究。

R74

A

1005-9202(2017)01-0017-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.007

1 吉林省细胞功能与药理重点实验室 延边大学医学部生理学与病理生理学教研室 2 延边大学附属医院骨科