60Co-γ射线辐照灭菌对清热祛浊丸中橙皮苷含量的影响*

王恒桓 李 博 王鹏程

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰安市中医医院，山东 泰安 271000)

60Co-γ射线辐照灭菌对清热祛浊丸中橙皮苷含量的影响*

王恒桓1，2李 博2王鹏程1

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰安市中医医院，山东 泰安 271000)

目的 研究不同60Co-γ射线辐照剂量对清热去浊丸中橙皮苷含量的影响，为清热祛浊丸提供合理的灭菌方式。方法 采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-2%冰醋酸水溶液(V∶V=33∶67)为流动相，检测波长284 nm，建立HPLC含量测定方法测定清热祛浊丸中橙皮苷的含量，并将橙皮苷作为代表成分，通过测定不同60Co-γ射线辐照剂量对清热祛浊丸中橙皮苷含量来评价60Co-γ射线辐照灭菌对清热祛浊丸有效成分的影响。结果 不同60Co-γ射线辐照剂量灭菌，清热祛浊丸中橙皮苷含量基本无变化。结论60Co-γ射线辐照可以作为清热祛浊丸的灭菌方法。

清热祛浊丸；橙皮苷；60Co-γ射线辐照；高效液相色谱法

清热祛浊丸的制备工艺为全粉入药，含有丰富的有机质，在储存过程中易发生霉变，使其含菌量超过国家药品卫生标准，直接影响制剂成品的质量，杀菌消毒方式不当易影响其保存和使用效果，因此，为了保证清热祛浊丸的卫生质量，在制剂生产过程中需要对成品进行灭菌处理。传统的灭菌方法如蒸汽压力灭菌、紫外线及微波灭菌等对中药的成分影响较大，60Co-γ射线辐照灭菌法是一种新型、高效的药品灭菌方法，具有穿透力强、常温灭菌、灭菌快速、易于操作及对大规模生产实用性高等特点，近年来得到越来越广泛的应用[1]。但由于其成分复杂，普遍含有淀粉、糖、氨基酸及碳氢化合物等物质，辐照可能会诱发某些反应的发生，引起其有效成分的变化[2]，因此清热祛浊丸辐照前后有效成分是否发生变化成为研究重点。

清热祛浊丸是由陈皮、金银花、连翘、苦参、栀子、蒲公英等十九味药材粉碎，过筛，混匀，用水泛丸，干燥即得。陈皮味苦、辛，温。归肺、脾经，理气健脾，燥湿化痰[3]。用于脘腹胀满，食少吐泻，咳嗽痰多。陈皮为本方中臣药，具有有效的HPLC指标控制成分及方法且常作为中成药物的质控标准，其有效成分橙皮苷[4]易被氧化破坏，具有代表性。因此我们依据《药典》方法将其质控成分陈皮中的橙皮苷作为此水丸中的代表成分进行灭菌后成分影响研究。

1 材料

1.1 仪器

岛津ATY124电子天平；PQ3120型超声仪：上海楚定分析仪器有限公司；高效液相色谱仪(LC-20 AB泵、SIL-20 A自动进样器)：日本岛津公司。

1.2 药品与试剂

不同60Co-γ射线辐照剂量灭菌的清热祛浊丸及未灭菌的清热祛浊丸(泰安市中医医院医院制剂，批号：160525)；橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110722-201312，纯度：94.7%)；甲醇(美国Sigma公司，色谱纯)；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测器：紫外检测器；流动相：甲醇-2%冰醋酸水溶液(V∶V=33∶67)；检测波长：284 nm；进样量：10 μl。在上述色谱条件下，理论板数以橙皮苷计≥2000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 分别取未进行60Co-γ射线辐照的样品及辐射剂量为2.5 kGy、5 kGy、10 kGy、15 kGy的清热祛浊丸适量，研细，精密称定约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，放冷，用甲醇补足质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液 取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含44.22 μg的溶液，即得。(操作过程与数据：取橙皮苷对照品适量，精密称定为11.60 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得橙皮苷对照品储备液；含量为0.2211 mg/ml；精密量取上述储备液2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，含量为44.22 μg/ml。)。

2.2.3 阴性对照溶液 取处方中除去陈皮的其他药味，按处方比例制成缺陈皮阴性对照样品，按照“2.2.1”项下供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液，即得。

2.3 测定条件的考察

2.3.1 测定波长的选择 取橙皮苷对照品溶液加甲醇稀释在190～400 nm光谱扫描，其最大吸收波长为284 nm，同时参考《药典》药材项下橙皮苷含量测定检测波长为283 nm，经验证样品在284 nm时吸收最大，杂质最少，因此确定284 nm为检测波长。

2.3.2 流动相考察 以方中陈皮的质控成分橙皮苷为考察对象，参照《药典》以橙皮苷分离度、保留时间、对称因子、理论塔板数等进行考察。精密吸取2份“2.2.2”项下对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，分别采用甲醇-2%冰醋酸水溶液(V∶V=33∶67)的流动相和甲醇-2%冰醋酸水溶液(V∶V=32∶68)洗脱，其他色谱条件与“2.1”项下条件相符，观察高效液相色谱图，记录峰面积，见表1。结果表明选择甲醇-2%冰醋酸水溶液(V∶V=33∶67)为流动相效果更好。

表1 流动相考察结果

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性实验 分别精密吸取同一批号样品制备的供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪进行测定。结果，色谱图中供试品溶液与对照品溶液在相同的位置上有相应色谱峰，阴性对照溶液上无相应色谱峰，说明处方中其他药味对测定结果无干扰，见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液图1 高效液相色谱图

2.4.2 耐用性试验 将检测波长及色谱柱类型进行微小变动，其他参数不变，以含量为依据,考察方法耐用性。结果，不同检测波长和色谱柱条件下测定RSD分别为0.1173%、0.4949%，表明本方法耐用性良好，见表2～3。

表2 检测波长考察

表3 色谱柱考察

2.4.3 线性范围考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品储备液溶液2 ml、5 ml、10 ml、15 ml、20 ml分别用甲醇稀释至50 ml，各取10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，进样质量(X，μg)为横坐标进行线性回归[5]，回归方程为：y =1821182.88x-1206.98，相关系数R=0.9999，结果表明橙皮苷溶液在0.0884～0.8844 μg之间呈良好的线性关系。见图2。

图2 橙皮苷标准曲线

2.4.4 精密度考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积。结果，橙皮苷峰面积的RSD=0.061%(n=6)，表明仪器精密度[6]良好。

2.4.5 稳定性考察 精密量取“2.2.1”项下未经辐射灭菌的供试品溶液10 μl，分别于0 h、2 h、4 h、6h、12 h、24 h，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。结果，橙皮苷峰面积的RSD=0.016%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好[7]，满足测定需要。

2.4.6 重复性考察 取同一批未辐射灭菌的样品，平行取6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，每份平行进2针，精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD=0.3123%，表明本方法重复性良好。

2.4.7 加样回收考察 经过查阅大量文献[8-10]，加样回收实验如下：取未辐射灭菌的本品适量，研细，平行取6份样品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.2.2”项下橙皮苷对照品储备液5ml，甲醇溶液25 ml，密塞，称定质量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，放冷，用甲醇补重，摇匀，滤过,取续滤液,即得供试品溶液。精密吸取上述6份供试品溶液及“2.2.2”项下对照品溶液各10 μl分别注入液相色谱仪，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。测定结果见表4。

2.4.8 样品含量测定 取不同60Co-γ射线辐照剂量灭菌的样品及未灭菌的样品适量，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件分别精密吸取样品溶液10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算橙皮苷含量，见表5。

表4 加样回收率考察

表5 样品含量测定结果(mg/g)

由表5可知，60Co-γ射线照射灭菌对清热祛浊丸中橙皮苷含量无明显影响，未辐照灭菌的清热祛浊丸与辐照过的清热祛浊丸相比较，橙皮苷的含量基本无变化。

3 讨 论

利用高效液相色谱法对不同辐照剂量清热祛浊丸中的橙皮苷进行了研究，60Co-γ射线照射灭菌对橙皮苷含量基本无影响，即使在含量测定的结果中可以看到随着辐照强度的增强，橙皮苷含量有下降的趋势，但并未有太大波动，在正常范围内。结果表明可以将60Co-γ射线照射灭菌法应用于清热祛浊丸的消毒。

[1] 孙建宇，陈红梅，李兆奎，等.60Co-γ射线辐照对赤芍和黄荃有效成分的影响[J].中国药师，2007,10(8):777-778.

[2] Ahn DU，Olson D G，Jo C，et al.Effect of muscle type,packaging, and irradiation on lipid oxidation，volatile Production，and color in raw pork patties[J]. Meat Sci,1998, 49:27-39.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：化学工业出版社,2015：283-284.

[4] 钱俊臻，王伯初.橙皮苷的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2010,22(1):176-180.

[5] 李园园，石磊.枳苓六妙口服液中活性成分研究[J].中医学报，2014,29(9):1330.

[6] 金林，赵万顺，郭巧生，等.白芍饮片的化学成分测定及质量评价[J].中国中药杂志，2015,40(3):484-489.

[7] 杨佳静，薛佳，周华方，等.HPLC法同时测定胃苏颗粒中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量[J].中国药房,2014,25(4):372-374.

[8] 张艳艳，曹淑娟，陈汝红，等.HPLC法测定接骨七厘片中柚皮苷的含量[J].中国药房,2014,25(28):2676-2677.

[9] 陈忠新，李强，戴临风，等.真武汤颗粒剂质量标准研究[J].黑龙江医药,2015,28(1):52-55.

[10] 李碧艳，李梅丽，蓝小霞.超高效液相色谱法测定肚液散中甘草酸的含量[J].海峡药学,2015,27(12):50-52.

Effect of60Co-γ irradiation sterilization on the content of hesperidin in Qingre Quzhuo Wan

WANG Heng-huan1，2LI Bo2WANG Peng-cheng1

(1.Taishan Medical University, Taian 271016,China; 2.Taian Chinese Medicine Hospital, Taian 271000,China)

Objective: To study the influence of60Co-γ irradiation sterilization on the content of Hesperidin in Qingre Quzhuo Wan, and to provide a reasonable method of sterilization for Qingre Quzhuo Wan.Methods: ODS-3 C18column (250 mm×4.6 mm,5 μm) was used and the mobile phase consisted of methanol-2% Glacial acetic acid solution(V∶V=33∶67) with UV detector. At the defection wave length of 284 nm HPLC method determination of the content of hesperidin in Qingre Quzhuo Wan was established and hesperidin was used as representative composition. The measuring of different60Co-γ irradiation dose of dispelling hesperidin content in Qingre Quzhuo Wan was used to evaluate60Co-γ irradiation sterilization effect on active ingredients of dispelling turbidity.Results: At different doses of60Co-γ irradiation sterilization, Qingre Quzhuo Wan content of hesperidin had no change.Conclusion:60Co-γ irradiation can be used as the sterilization method of Qingre Quzhuo Wan.

Qingre Quzhuo Wan; Hesperidin;60Co-γ irradiation; HPLC

王恒桓(1967—)，男，山东泰安人，副主任技师，本科，主要从事放射医学工作。

王鹏程，wpc163@163.com。

R927.2

A

1004-7115(2017)01-0020-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.01.006

2016-09-20)