肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化检测*

刘 莹，王圆圆,贾文青，倪 然，张 辉，王 静#，周 舫

1)郑州大学第一附属医院呼吸科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001

肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化检测*

刘 莹1)，王圆圆1),贾文青1)，倪 然1)，张 辉1)，王 静1)#，周 舫2)

1)郑州大学第一附属医院呼吸科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001

#通信作者，女，1958年11月生，博士，教授，主任医师，研究方向：肺癌发病机制和早期预警，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn

肺肿瘤；p16；FHIT；APC；甲基化

目的：检测肺癌患者血清中抑癌基因p16、FHIT、APC的甲基化，探讨它们在肺癌发生和诊断中的临床价值。方法：收集120例原发性肺癌患者(肺癌组)、46例肺良性疾病患者(对照组)的血液标本，采用甲基化PCR方法检测2组患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化。采用logistic回归分析肺癌发生的危险因素,计算上述基因甲基化诊断肺癌的准确率。结果：肺癌组血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分别为37.5%、34.2%、31.7%，对照组中分别为6.5%、13.0%、10.9%，差异有统计学意义(P均<0.05)。Logistic回归分析提示p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素,OR(95%CI)分别为7.509(2.160～26.099)、2.927(1.096～7.814)(P均<0.05)。p16、FHIT、APC基因甲基化单项诊断肺癌的准确率分别为53%、49%、47%，3种基因甲基化联合诊断肺癌的准确率为87%，优于单项指标。结论：p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素;联合检测p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌诊断的准确性。

恶性肿瘤严重威胁人类健康。近年来肺癌的发生率有逐渐升高的趋势，在我国肺癌已居城市人口恶性肿瘤死因第一位[1]。DNA甲基化是真核生物体内的一种基因内源性修饰，在DNA甲基转移酶的催化下，使胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶，进而影响其基因的表达[2]。如果这种现象发生在抑癌基因，则造成抑癌基因功能缺失或下降[3]。作者对郑州大学第一附属医院2013年至2014年收治的120例肺癌及46例肺良性疾病患者血清中抑癌基因p16、脆性组氨酸三联体基因(fragile histidine triad gene，FHIT)、APC的甲基化进行了检测，探讨上述3种基因甲基化和肺癌发生的关系以及在肺癌诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 肺癌组纳入标准：原发性肺癌，均有组织病理学诊断依据，按国际抗癌联盟公布的TNM分期标准进行分期；排除标准：合并其他恶性肿瘤，有手术或放、化疗史。根据以上标准收集原发性肺癌患者120例，其中男67例，女53例；年龄36～71岁，中位年龄56岁；120例中肺鳞癌52例，肺腺癌36例，小细胞肺癌32例；根据TNM分期标准，Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期67例。对照组为肺良性疾病46例，男30例，女16例；年龄14～67岁，中位年龄47岁；肺脓肿14例，支气管扩张18例，肺结核14例。病例资料的收集均征得受试者知情同意。

1.2 主要试剂和仪器 血清基因组DNA提取试剂盒及引物(广州生物工程公司)， GoTaq qPCR Mastermix(美国Promega公司)，PTC200型PCR扩增仪(MJ Research公司)，MX3000P PCR仪(STARTAGENE公司)。

1.3 甲基化PCR检测 2组均采集5 mL清晨空腹静脉血，-80 ℃保存。使用时严格按血清基因组DNA提取试剂盒的操作说明进行。参照文献[1-2]设计p16、FHIT、APC基因甲基化特异性序列(M)和非甲基化特异性序列(U)。引物合成由广州生物工程公司完成。见表1。甲基化PCR：①DNA的亚硫酸氢盐的处理。DNA加入NaOH，水浴30 min充分变性后，加入氢醌和pH为5的亚硫酸氢钠溶液。通过以上处理，已被甲基化的胞嘧啶不会发生改变，而未甲基化的胞嘧啶则会变为尿嘧啶。修饰后的DNA可用于进行PCR扩增。②PCR扩增。对甲基化及非甲基化的p16、FHIT、APC基因启动子序列进行PCR扩增的反应体系如下：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，分别将4 μL亚硫酸氢盐处理后的DNA模板加入反应体系中，并加水至20 μL；甲基化的阳性对照为经过甲基转移酶和亚硫酸氢盐处理的胎盘DNA，阴性对照为正常外周血淋巴细胞DNA，空白对照为H2O。

表1 p16、FHIT、APC基因的甲基化引物

1.4 统计学处理 用SPSS 17.0分析数据。将单因素分析中有意义的变量纳入多因素非条件logistic回归模型，筛选影响肺癌发生的危险因素；应用标准公式计算3种基因甲基化单独或联合(串联)检测肺癌的敏感度、特异度、准确率。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DNA甲基化的分析 结果见图1。

2.2 单因素分析设定变量与肺癌发生的关系 结果见表2。由表2可知,肺癌组血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分别为37.5%、34.2%、31.7%，对照组中分别为6.5%、13.0%、10.9%，差异有统计学意义。

2.3 Logistic回归分析 设定是否患肺癌为因变量，将单因素分析中有意义的因素纳入logistic回归分析，采用逐步回归法(纳入标准为0.05，排除标准为0.10)建立模型，变量赋值如下：肺良性疾病=0，肺癌=1；p16、FHIT和APC基因未甲基化=0，甲基化=1。结果(表3)显示，p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素。

2.4 3种基因甲基化诊断肺癌的临床评价结果 见表4。

1：DNA Marker；U：无甲基化的基因；M：甲基化的基因；NL：正常外周血淋巴细胞DNA；IVD：阳性对照；H2O：空白对照。图1 FHIT(A)、p16(B)及APC(C)甲基化检测结果

表3 Logistic回归分析

表4 3种基因甲基化诊断肺癌的临床评价 %

3 讨论

FHIT含编码组氨酸三联体蛋白的功能区，位于染色体3p14．2区，且易断裂。FHIT是许多类型肿瘤的抑癌基因[4]。Wu等[5]进行了一项荟萃分析显示：在高加索人群和亚洲人群中，非小细胞肺癌组织中FHIT基因甲基化水平明显高于非肿瘤组织；FHIT基因甲基化也与吸烟史、病理类型、生存率相关。该研究中肺癌患者血清中FHIT基因甲基化率高于肺良性疾病患者，且FHIT基因甲基化是肺癌发生的危险因素，提示FHIT基因甲基化可能参与了肺癌的发病机制。

抑癌基因APC位于人类染色体5q21，含21个外显子,长度为8 535 bp，是Wnt信号传导通路中的重要基因。该抑癌基因启动子区过度甲基化使基因表达缺失或活性下降，导致Wnt信号传导通路异常。Schneikert等[6]研究表明APC基因启动子高甲基化可见于结直肠癌、肺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤。Feng等[7]的研究表明，APC基因启动子甲基化与TNM分期、淋巴结转移、吸烟有关，与年龄无关；APC基因在肺癌组织中的甲基化率为22.0%，在非肿瘤组织中为14.6%。Ding等[8]研究认为空气中的有害物质PM10、PM2.5和NO2浓度增高，APC基因甲基化率增加。Huang等[9]对151项研究进行的荟萃分析提示，在鉴别肺鳞癌和腺癌中，APC的特异性和敏感性均高于CDKN2A、MGMT和RUNX3基因。该研究发现肺癌患者血清中APC基因甲基化率高于肺良性疾病患者，但并非肺癌发生的危险因素。

p16在细胞周期调节中发挥着重要作用，是细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制剂。p16基因的甲基化是肿瘤发生发展中常见的改变。研究[10]表明，p16基因甲基化率在肺癌患者中明显增高，与TNM分期无关，p16启动子甲基化率在腺癌患者高于鳞癌患者，在吸烟患者高于不吸烟者。该研究结果显示p16基因甲基化是肺癌发生的危险因素，提示p16基因甲基化亦参与了肺癌的发病机制。

另外，该研究结果还显示，p16、FHIT、APC基因甲基化单项检测肺癌的准确率分别为53%、49%、47%，3种基因甲基化联合诊断肺癌的准确率为87%，优于单项检测。

综上所述，p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素;联合检测p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌诊断的准确性，从而为肺癌的诊断及评估提供参考。

[1]徐小艳,王晓卫,阙菡雅,等.沉默NOX1表达对A549细胞增殖的影响[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(3):330

[2]王威,冯晓蕾,段晓冉,等.基于3种基因启动子甲基化联合端粒长度构建肺癌诊断支持向量机模型[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(4):462

[3]王威,段晓冉,谭善娟,等.基于3种基因启动子甲基化联合端粒长度构建肺癌筛查神经网络模型[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(2):176

[4]LIN HY,HUNG SK,LEE S,et al.DNA methylome analysis identifies epigenetic silencing of FHIT as a determining factor for radiosensitivity in oral cancer: an outcome-predicting and treatment-implicating study[J].Oncotarget,2015,6(2):915

[5]WU X,WU G,YAO X,et al.The clinicopathological significance and ethnic difference of FHIT hypermethylation in non-small-cell lung carcinoma: a meta-analysis and literature review[J].Drug Des Devel Ther,2016,10:699

[6]SCHNEIKERT J,BEHRENS J.The canonical Wnt signalling pathway and its APC partner in colon cancer development[J].Gut,2007,56(3):417

[7]FENG H,ZHANG Z,QING X,et al.Promoter methylation of APC and RAR-β genes as prognostic markers in non-small cell lung cancer(NSCLC)[J].Exp Mol Pathol,2016,100(1):109

[8]DING R,JIN Y,LIU X,et al.Characteristics of DNA methylation changes induced by traffic-related air pollution[J].Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen,2016,796:46

[9]HUANG T,LI J,ZHANG C,et al.Distinguishing lung adenocarcinoma from lung squamous cell carcinoma by two hypomethylated and three hypermethylated genes:a meta-analysis[J].PLoS One,2016,11(2):e0149088

[10]PASTUSZAK-LEWANDOSKA D,KORDIAK J,MIGDALSKA-SEK M,et al.Quantitative analysis of mRNA expression levels and DNA methylation profiles of three neighboring genes: FUS1, NPRL2/G21 and RASSF1A in non-small cell lung cancer patients[J].Respir Res,2015,16:76

(2016-05-30收稿 责任编辑徐春燕)

Determination of p16, FHIT and APC gene methylation in serum from patients with lung cancer

LIUYing1),WANGYuanyuan1),JIAWenqing1),NIRan1),ZHANGHui1),WANGJing1),ZHOUFang2)

1)DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

lung neoplasm;p16;FHIT;APC;gene methylation

Aim: To study the roles of p16, FHIT and APC methylation in carcinogenesis and diagnosis of lung cancer.Methods: Methylation PCR was used to detect the methylation of p16,FHIT,and APC genes in 120 cases of lung cancer(lung cancer group) and 46 cases of benign lung disease(control group). The risk factors for lung cancer were researched by logistic multivariate analysis, and the accuracy of gene methylation in the diagnosis of lung cancer was assessed.Results: The rates of p16, FHIT, and APC gene methylation in lung cancer group were 37.5%,34.2% and 31.7%, those in control group were 6.5%,13.0%, and 10.9%, and the differences were significant(P<0.05). Logistic multivariate analysis suggested that p16 and FHIT gene methylation was risk factor for lung cancer(P<0.05)[OR(95%CI)=7.509(2.160-26.099),2.927(1.096-7.814)].The accuracy of p16,FHIT,APC gene methylation single use for diagnosis of lung cancer was 53%,49%,47%, while the accuracy of the 3 gene combined detection was 87%, better than single detection.Conclusion: The methylation of p16 and FHIT gene may be related to the carcinogenesis of lung cancer,and the com bined detection may improve the accuracy of diagnosis of lung cancer.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.014

*河南省教育厅科技攻关项目 12A320020；河南省科技厅创新人才项目 154200510015

R735.2