婴儿双歧杆菌对ConA诱导小鼠肝纤维化的影响*

刘 超，郭 琦，郑鹏远，刘 霞，于 泳，唐芙爱，赵治国

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州 450014 2)郑州大学第二附属医院超声科 郑州 450014 3)郑州大学第五附属医院消化内科 郑州 450052

婴儿双歧杆菌对ConA诱导小鼠肝纤维化的影响*

刘 超1)，郭 琦2)，郑鹏远3)#，刘 霞1)，于 泳3)，唐芙爱1)，赵治国1)

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州 450014 2)郑州大学第二附属医院超声科 郑州 450014 3)郑州大学第五附属医院消化内科 郑州 450052

#通信作者，男，1965年2月生，博士，教授，主任医师，研究方向：胃肠道感染与免疫，E-mail:medp7123@126.com

婴儿双歧杆菌;小鼠;肝纤维化;刀豆蛋白

目的：研究婴儿双歧杆菌对刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠肝纤维化的作用及其机制。方法：36只小鼠随机分为正常组、模型组和婴儿双歧杆菌组，每组12只。正常组静脉注射生理盐水，模型组和婴儿双歧杆菌组静脉注射12.5 mg/kg ConA溶液，每周1次。每日通过灌胃给予正常组和模型组蒸馏水，婴儿双歧杆菌组通过灌胃给予0.5 g/kg婴儿双歧杆菌溶液，持续7周。检测小鼠肝脏质量指数，小鼠血清肝功能生化指标(ALT、AST、ALB)，透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原肽(PC Ⅲ)的水平，以及小鼠肝组织Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1、基质蛋白金属酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-9、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10的含量。结果：婴儿双歧杆菌能显著降低ConA诱导小鼠的肝脏质量指数(P<0.05)，改善血清肝功能生化指标(P<0.05)，降低血清HA、PC Ⅲ水平(P<0.05)，降低肝组织中ColⅠ、Col Ⅲ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TNF-α、IL-6含量(P<0.05)，升高小鼠肝组织中MMP-1、IL-10含量(P<0.05)。结论：婴儿双歧杆菌具有明确的抗小鼠肝纤维化作用。

肝纤维化是各种病因导致的肝脏内结缔组织的异常增生，肝纤维化的持续发展最终将导致肝硬化的发生。肝纤维化是一个可逆的过程，防止肝纤维化的发生发展是防治肝硬化的重要措施[1-2]。研究[3-6]表明，益生菌可通过免疫调节机制改善小鼠肠道状况，也可治疗实验动物的肝炎、肝硬化等，提示益生菌可能通过免疫调节机制抑制免疫反应诱发的肝纤维化。婴儿双歧杆菌是一种重要的益生菌，具有调节肠道菌群、调节免疫反应、抗肿瘤、抗感染等生物学活性，可能通过调节机体特异性或非特异性免疫反应发挥抗肝纤维化作用[7]。该研究建立刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导的免疫性小鼠肝纤维化模型，研究婴儿双歧杆菌抗小鼠肝纤维化的作用，初步明确其作用机制，为应用婴儿双歧杆菌治疗肝纤维化提供可靠的实验依据[8-9]。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 4周龄雄性BALB/c小鼠36只，购于河南省实验动物中心，合格证号 SCXK(豫)2010-0002。婴儿双歧杆菌粉(山东科兴生物制品有限公司)，ConA(美国Sigma公司)，小鼠透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原肽(PC Ⅲ)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1、基质蛋白金属酶(MMP)-1、MMP-2、MMP-9 ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 实验分组与造模 小鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为：正常组、模型组、婴儿双歧杆菌组，每组12只。于造模首日，正常组静脉注射生理盐水，模型组和婴儿双歧杆菌组静脉注射12.5 mg/kg ConA的溶液，此后每周注射1次，连续7周。于造模首日起，每日给予正常组和模型组蒸馏水灌胃，婴儿双歧杆菌组给予婴儿双歧杆菌溶液灌胃，剂量0.5 g/kg，每日1次，持续7周。末次给药后，各组小鼠禁食不禁水12 h，称重后摘眼球取血，将收集的全血放置于1.5 mL离心管静置60 min，4 ℃3 500 r/m离心15 min，取血清保存于-20 ℃冰箱，用于血清指标检测。取血完毕后脱颈椎处死小鼠，摘取小鼠肝脏组织，生理盐水冲洗干净后称重。每只小鼠取3片肝组织，将其中一片置于体积分数10%甲醛溶液固定，经常规病理组织学检查；另外两片肝组织经液氮冷冻后于-80 ℃低温冰箱中保存，用于指标检测。

1.3 小鼠肝脏质量指数 电子天平称量小鼠空腹体重及肝脏质量，计算肝脏质量与空腹体重比(mg/g)，即肝脏质量指数。

1.4 小鼠血清ALT、AST和ALB水平检测 取小鼠血清，全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、ALB水平。

1.5 小鼠肝纤维化因子及炎症因子检测 取小鼠血清，ELISA法检测HA和PC Ⅲ的含量。取肝组织匀浆，ELISA法检测ColⅠ、Col Ⅲ、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.6 小鼠肝组织细胞外基质相关因子检测 取肝组织匀浆，ELISA法检测TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-9的含量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0分析。3组小鼠各指标的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠肝脏病理组织学表现 正常组小鼠肝组织内肝细胞排列整齐，肝小叶结构正常，未见炎性细胞浸润及细胞变性坏死。模型组及婴儿双歧杆菌组小鼠肝组织内肝细胞排列紊乱，肝小叶结构破坏，汇管区结缔组织增生，可见炎性细胞浸润及细胞变性坏死。婴儿双歧杆菌组小鼠肝组织内纤维化程度较模型组减轻。见图1。

A:正常组；B: 模型组；C:婴儿双歧杆菌组。图1 3组小鼠肝组织HE染色结果(×200)

2.2 3组小鼠肝脏质量指数和血清ALT、AST、ALB水平的比较 结果见表1。与正常组相比，模型组小鼠肝脏质量指数显著升高，血清ALT、AST水平显著升高，ALB水平显著降低。与模型组相比，婴儿双歧杆菌组小鼠上述指标明显改善。

2.3 3组小鼠肝纤维化因子及炎症因子水平的比较 结果见表2、3。与正常组相比，模型组小鼠血清HA、PC Ⅲ及肝组织ColⅠ、Col Ⅲ、TNF-α、IL-6含量升高，IL-10含量降低。与模型组相比，婴儿双歧杆菌组小鼠血清HA、PCⅢ浓度降低，肝组织中ColⅠ、Col Ⅲ和TNF-α、IL-6含量降低，IL-10含量升高。

表1 3组小鼠肝脏质量指数和血清ALT、AST和ALB水平的比较

*：与正常组相比,P<0.05；#:与模型组相比，P<0.05。

表2 3组小鼠肝纤维化因子HA、PC Ⅲ、ColⅠ和Col Ⅲ的比较

*：与正常组相比,P<0.05；#:与模型组相比，P<0.05。

表3 3组小鼠炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的比较 mg/kg

*：与正常组相比,P<0.05；#:与模型组相比，P<0.05。

2.4 3组小鼠肝组织TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量的比较 结果见表4。与正常组相比，模型组小鼠肝组织TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量升高，MMP-1含量降低。与模型组相比，婴儿双歧杆菌组小鼠肝脏TIMP-1、MMP-2、MMP-9含量降低，MMP-1含量升高。

表4 3组小鼠肝脏组织TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-9含量的比较 mg/kg

*：与正常组相比,P<0.05；#:与模型组相比，P<0.05。

3 讨论

在肝纤维化发展过程中，多种信号转导通路的平衡被打破，各种促肝纤维化因子的合成增加、活性发生变化，而抗肝纤维化因子的效应减弱或受到抑制，细胞外基质代谢失衡而发生过度沉积，最终导致肝硬化的发生。MMPs是一组可降解细胞外基质的重要酶类，而TIMPs则能够结合MMPs以降低其表达，肝损伤发生后肝组织内MMPs减少，TIMPs增加[10]。PCⅢ、ColⅣ、层黏连蛋白、HA与肝纤维化的活动程度密切相关，均可反映肝纤维化因子合成状况和炎症活动程度。自身免疫反应引起的TNF-α和白介素家族的异常表达是免疫性肝纤维化形成的主要原因之一[11-12]。在免疫功能紊乱的情况下，TNF-α可引起细胞外基质合成和沉积，最终导致肝纤维化形成[13-14]。IL-6可促进肝成纤维细胞增生和胶原合成，并可影响肝脏组织内MMPs和TIMPs的合成和降解，从而发挥促肝纤维化作用[15]。IL-10可下调MMPs的表达和抑制TIMPs的合成，通过免疫调节机制发挥抗纤维化的作用[16]。李延玲等[4]研究发现，含双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、肠球菌三联活菌的益生菌胶囊能抑制肝硬化大鼠肝细胞凋亡，具有肝脏保护作用。Zuo等[6]研究发现，婴儿双歧杆菌可调节T细胞亚型的生物学功能，通过干预细胞免疫而缓解结肠炎症状。

该研究选择ConA作为诱导剂，建立小鼠自身免疫性肝纤维化动物模型，经病理证实模型组和婴儿双歧杆菌组小鼠肝纤维化存在。该研究结果显示与正常组相比，模型组小鼠肝功能指标(肝脏质量指数、ALT、AST、ALB)和肝纤维化指标(HA、PC Ⅲ、ColⅠ、Col Ⅲ)含量明显升高，炎症因子及细胞外基质相关因子(TNF-α、IL-6、IL-10、TIMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-1)均明显异常，而与模型组相比，婴儿双歧杆菌组小鼠以上指标均有显著改善，说明婴儿双歧杆菌可能通过干预肝纤维化因子、炎症因子及细胞外基质相关因子等指标而发挥抗肝纤维化的作用。

总之，该研究结果显示给予肝纤维化小鼠婴儿双歧杆菌可能抑制肝纤维化，其作用机制可能与调节肝脏TNF-α，IL-6和 IL-10表达，进而调节小鼠肝纤维化过程中的免疫反应有关。

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(2016-09-11收稿 责任编辑李沛寰)

Effect of infant bifidobacteria on liver fibrosis of mice induced by ConA

LIUChao1)，GUOQi2)，ZHENGPengyuan3)，LIUXia1)，YUYong3)，TANGFu′ai1)，ZHAOZhiguo1)

1)DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014DepartmentofUltrasound,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014DepartmentofGastroenterology,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

infant bifidobacteria;mouse;liver fibrosis;concanavalin

Aim: To research the preventive effects and mechanism of infant bifidobacteria on liver fibrosis of mice induced by concanavalin A(ConA). Methods: The mice were randomly allocated into three groups: normal group, model group and infant bifidobacteria-treated group，12 in each group. The ConA solution(12.5 mg/kg) was given by intravenous injection to the model group and infant bifidobacteria-treated group once a week, normal group and model group were given normal saline by gavage,and infant bifidobacteria-treated group was given infant bifidobacteria(0.5 g/kg) by gavage once a day. After 7 weeks, liver weight index, liver function, concentrations of HA and PCⅢ in serum, as well as collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, MMP-1, MMP-2, MMR-9, TIMP-1,TNF-α, IL-6, IL-10 in liver tissue were determined. Results: Infant bifidobacteria could decrease liver weight index(P<0.05), improve the liver function(P<0.05), decrease the serum concentrations of HA and PC Ⅲ(P<0.05), decrease the contents of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, MMP-2, MMR-9, TIMP-1,TNF-α, IL-6(P<0.05) in mice liver tissue, and increase the contents of MMP-1 and IL-10 in mice liver tissue(P<0.05).Conclusion: Infant bifidobacteria could prevent liver fibrosis of mice induced by ConA.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.004

*国家自然科学基金资助项目 81370494;郑州市科技领军人才项目 131PLIRC656

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