腺苷A2A受体对新生小鼠离体延髓脑片基本节律性呼吸放电的调节作用*

闫思涵，刘友才，千智斌

1)新乡医学院机能学实验室 河南新乡 453003 2)新乡市结核病防治所 河南新乡 453000 3)新乡医学院三全学院 河南新乡 453003

腺苷A2A受体对新生小鼠离体延髓脑片基本节律性呼吸放电的调节作用*

闫思涵1,2)，刘友才3)，千智斌1)#

1)新乡医学院机能学实验室 河南新乡 453003 2)新乡市结核病防治所 河南新乡 453000 3)新乡医学院三全学院 河南新乡 453003

#通信作者，男，1974年7月生，博士，教授，研究方向：延髓呼吸中枢病变机制,E-mail：qianzhibin@126.com

腺苷A2A受体；新生小鼠；延髓脑片；基本节律性呼吸放电

目的：探讨腺苷A2A受体对新生小鼠离体延髓脑片基本节律性呼吸放电(RRDA)的调节作用。方法：制备新生小鼠离体延髓脑片，分别使用含0.0、2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L腺苷A2A受体激动剂CGS21680或拮抗剂SCH58261的人工脑脊液(ACSF)灌流脑片，每个浓度灌流10 min，在每个浓度灌流第6 min时，使用吸附电极记录脑片RRDA，分析吸气时程(TI)、放电积分幅度(IA)和呼吸周期(RC)。结果：CGS21680可以缩短RC，增加TI和IA(P<0.001),对RRDA有兴奋作用。SCH58261则可以延长RC，减小TI和IA(P<0.001),对RRDA有抑制作用。结论：腺苷A2A受体参与调节新生小鼠延髓RRDA，激活腺苷A2A受体对RRDA有兴奋作用。

基本节律性呼吸放电(rhythmic respiratory discharge activity,RRDA)源自延髓呼吸中枢，是呼吸运动的前提和基础，对机体的存活起着至关重要的作用[1]。大量研究[2-3]表明延髓面神经后核内侧区(medial region of the nucleus fetrofacialis，mNRF)在RRDA的发生中起关键作用，可能是其产生部位。腺苷全称腺嘌呤核苷酸，由腺嘌呤和戊糖结合而成，是一种内源性神经递质，通过与细胞膜上的腺苷受体结合，调节细胞的突触后功能。目前已发现哺乳动物的腺苷受体有A1、A2A、A2B和A3等4种亚型[4]，均为G蛋白偶联受体，广泛分布于神经系统、心血管系统、消化系统和呼吸系统等，被激活后通过调节腺苷酸环化酶、离子通道、磷脂酶等物质活性产生生物效应[5]。有研究[6]发现延髓头端腹外侧区神经元细胞膜上存在腺苷A2A受体。为明确腺苷A2A受体是否参与对新生小鼠延髓RRDA的调节，作者设计并完成了该实验，为新生动物延髓呼吸中枢发育和相关疾病的预防、治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6小鼠购自上海史莱克实验动物有限公司,常规饲养，自然光照，选取2 d新生小鼠用于实验，雌雄不拘。

1.2 试剂 腺苷A2A受体特异性激动剂CGS21680和特异性阻断剂SCH58261购自Sigma-Aldrich公司。配制人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)所用试剂(NaCl 126 mmol/L,KCl 5 mmol/L,MgSO41.3 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,NaHCO326 mmol/L,葡萄糖30 mmol/L)为国产分析纯。体积分数95%O2+体积分数5%CO2混合气体购自河南源正科技公司。

1.3 离体延髓脑片标本的制备和RRDA记录 2 d新生小鼠使用乙醚深麻醉后在颈4和颈5之间断头，将鼠头迅速置于0 ℃ACSF中清洗并降温5～10 s后转入解剖盒内，盒内盛有经氮氧混合气体充分饱和(平衡1 h以上)的冰ACSF，操作过程中持续通气。使用眼科剪沿颅骨剪去正中皮肤和肌肉，从颈椎处剪开椎管并向吻端延伸，直至完整剪开颅骨，去除颅骨及脑桥以上的脑组织，用手术刀片分离颅底脑神经至颈2、3段脊髓，游离出延髓、脊髓，完整保留舌下神经根。迅速将标本头端向上移至切片槽内，腹侧面朝向刀刃，刀刃朝向头端倾斜20°，在闩前600 μm至闩后100 μm间切下延髓脑片(含舌下神经根)，将脑片置于灌流槽内，用改良Kreb液以2～4 mL/min持续灌流，保持pH 7.35～7.45，温度27～29 ℃。用含银-氯化银的吸附电极加以负压吸附舌下神经根，采用BL-420生物信号采集和处理系统进行RRDA的记录、分析和处理[7]。分别于灌流10、20、30、40和50 min后测量RRDA，根据各时间点RRDA数据有无统计学差异判断模型是否成立。稳定记录到RRDA后，分别使用含不同浓度(0.0、2.5、5.0、10.0、20.0 nmol/L)CGS21680或SCH58261的ACSF灌流脑片，每个浓度灌流10 min，在每个浓度灌流第6 min时测量RRDA。

1.4 测定指标 每个RRDA放电开始至放电结束的时间为吸气时程(inspiratory time, TI)，反映每次呼吸周期内的吸气持续时间；将一次放电的原始图进行积分获得放电积分幅度(integral amplitude, IA)，反映呼吸的幅度；一次吸气性放电开始至下一次放电开始的时间为呼吸周期(respiratory cycle，RC)，反映呼吸的快慢。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0进行数据处理，ACSF灌流延髓脑片不同时间、同一试药不同浓度作用条件下RRDA的比较采用重复测量数据的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 模型稳定性 以灌流10 min后测得的数据为100，对其余数据进行标准化处理。用ACSF灌流延髓脑片20、30、40、50 min后TI、IA、RC差异均无统计学意义(图1、表1)，表明ACSF灌流延髓脑片50 min内RRDA无衰减，实验模型稳定可靠。

图1 ACSF灌流脑片不同时间的RRDA

t(灌流)/minTIIARC20101．46±2．37101．33±6．81102．15±3．603099．78±4．31101．26±4．57100．72±5．2440100．63±4．2799．83±6．77100．87±3．265098．76±5．4397．82±4．4199．31±6．03F0．5730．4060．741P0．7070．7990．583

2.2 不同浓度CGS21680对延髓脑片RRDA的影响 以0 nmol/L 的CGS21680灌流数据为100，对其余数据进行标准化处理，结果见表2。表2显示，CGS21680可以缩短RC，增加TI和IA,对RRDA有兴奋作用；10 nmol/L的CGS21680对RRDA的作用达到最大效果，再提高CGS21680浓度，作用不再增强,提示10 nmol/L的CGS21680是兴奋RRDA的最适浓度。

表2 不同浓度CGS21680对RRDA的作用(n=6)

*：与2.5 nmol/L比较，P<0.05；#：与5.0 nmol/L比较，P<0.05。

2.3 不同浓度SCH58261对延髓脑片RRDA的影响 以0 nmol/L 的SCH58261灌流数据为100，对其余数据进行标准化处理，结果见表3。表3显示，SCH58261可以延长RC，减小TI和IA,对RRDA有抑制作用；10 nmol/L的SCH58261对RRDA的作用达到最大效果，再提高SCH58261浓度，作用不再增强,提示10 nmol/L的SCH58261是抑制RRDA的最适浓度。

表3 不同浓度SCH58261对RRDA的作用(n=6)

*：与2.5 nmol/L比较，P<0.05；#：与5.0 nmol/L比较，P<0.05。

3 讨论

离体脑片在记忆、发育和神经网络功能研究等方面被广泛应用，与在体实验相比具有明显的优势：首先是可排除高位中枢和外周反馈性输入对研究部位的干扰，从而提高研究的精确度[8]；其次离体脑片的机械稳定性在记录过程中显著提高，可满足细胞内记录、细胞外和膜片钳等电生理方法的要求[9]；第三，可以通过在培养液或灌流液中加入递质、药物、生长因子等物质精确控制细胞外液成分[10]。

该研究发现，腺苷A2A受体激动剂CGS21680对离体小鼠延髓脑片的RRDA有兴奋作用，腺苷A2A受体拮抗剂SCH58261则对RRDA有抑制作用。该实验结果说明，生理情况下mNRF神经元细胞膜存在腺苷受体，腺苷和受体结合可紧张性调节呼吸神经元电活动。腺苷A2A受体是G蛋白偶联受体[11]，受体被激活后，进一步激活腺苷酸环化酶[12]，位于胞质侧的腺苷酸环化酶可部分催化细胞内ATP生成环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，cAMP作为第二信使通过激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)产生生物效应[13-14]。腺苷A2A受体对RRDA的兴奋作用可能与通过受体途径抑制钾通道、增加钙内流以及增加兴奋性氨基酸有关[15-16]。

腺苷A2A受体在生理条件下紧张性调节延髓呼吸中枢功能，这有利于延髓呼吸中枢根据神经元细胞外液的腺苷浓度调节呼吸运动的强度，以适应机体的需氧量。病理情况下，如新生儿缺氧缺血性脑病[17]，脑组织缺氧使大量腺苷三磷酸水解，致使局部脑组织腺苷浓度明显升高；一方面腺苷浓度升高会增加神经元兴奋性，造成缺氧缺血神经元进一步损伤；但另一方面缺氧缺血部位的腺苷扩散可增加远处或其他血供正常部位脑组织的兴奋性，代偿缺血部位神经组织的功能，例如非延髓部位缺血缺氧造成的腺苷升高可间接引起延髓呼吸中枢兴奋，增加机体摄氧量[18-19]。

因此，作者认为，mNRF区吸气神经元和RRDA相关神经元细胞膜上腺苷A2A受体的异常可以引起基本呼吸节律的异常[20]。研究腺苷A2A受体对延髓呼吸中枢RRDA的作用和药物对腺苷A2A受体的作用机制对新生儿缺氧缺血性脑病等疾病的诊治有重大价值。

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(2016-05-25收稿 责任编辑王 曼)

Effects of adenosine A2A receptor on basic rhythmic respiration discharge activity of medulla oblongata slice from neonatal mice in vitro

YANSihan1,2),LIUYoucai3),QIANZhibin1)

1)DepartmentofFunctionalLaboratory,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003 2)XinxiangTuberculosisPreventionandTreatmentInstitute,Xinxiang,Henan453000 3)SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003

adenosine A2A receptor;neonatal mouse;medulla oblongata slice;basic rhythmic respiratory discharge activity

Aim: To investigate the effect of adenosine A2A receptor on basic rhythmic respiratory discharge activity(RRDA) of medulla oblongata slice from neonatal mice.Methods: Medulla oblongata slices in vitro from neonatal mice were prepared, and then perfused with artificial cerebrospinal fluid(ACSF) which containing 0.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 nmol/L adenosine A2A receptor agonist CGS21680 or antagonist SCH58261 for 10 min. At the 6th min of perfusion, adsorption electrode was used to record the inhale duration(TI), discharge integral amplitude (IA) and respiratory cycle (RC). Results: CGS21680 could shorten RC, increase TI and IA(P<0.001), excite RRDA; SCH58261 could extend RC, reduce TI and IA(P<0.001),and has inhibitory effect on RRDA. Conclusion: The adenosine A2A receptor may play an excitatory role in RRDA of medulla oblongata in neonatal mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.007

*河南省科技厅重点攻关项目 102102310156;新乡市科技局重点攻关项目 ZG14004

R332.3