应用多重Taqman-LNA荧光PCR同时检测肉制品中猪鸡鸭源性成分

许如苏 ， 纪玲珍 ， 黄 帅 ， 周广彪 ， 魏 霜 ， 段建发

(汕头出入境检验检疫局，广东 汕头 515031)

尽管在2013年欧洲马肉丑闻之后，我国相关部门开展了打击肉制品掺假整治活动，但由于不同肉种存在明显的物价差异，利益的驱使导致肉制品“掺假使假”现象难以杜绝，肉制品掺假时有报道，常见以猪肉、鸭肉等低价肉掺入甚至代替高价的牛羊肉[1-2]，并出现多肉种掺假趋势[3]。打击肉制品掺假工作任重而道远。

基于蛋白质的ELISA方法和基于核苷酸序列的分子生物学方法是肉种鉴别的主要方法。其中，具有稳定、准确、快速等优势的PCR技术已得到广泛的应用[4-6]，有的已成为肉种鉴别的标准方法[7-9]，但除了SN/T 2051-2008[8]等少数标准方法采用双重实时PCR方法同时检测不同肉种外，SN/T 2727-2010等多数标准[7、9-10]均为单一肉种检测方法，显然，现行标准方法尚难以满足肉制品打假的高通量快速鉴别需要。

本研究针对常见掺假肉种猪、鸡、鸭，利用Taqman-LNA荧光探针可提升Tm值，增加探针杂交的特异性[11]和设计灵活性[12]等优点，克服多重荧光PCR普通存在的不同目标序列扩增效率不一致等问题，建立了可同时检测上述3种肉源性成分的多重荧光PCR方法，达到了快速、经济、高效的检测目的。

1 材料与方法

1.1 样品 从农贸市场、饮食店和超市购买牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、兔等动物肌肉和牛肉丸、牛肉粒、牛肉片、羊肉串、羊肉丸、羊肉片、肉肠等肉制品。

1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪(BIO-RAD， CFX96)，样品破碎系统(北京格瑞德曼仪器设备有限公司，GT200)；Probes Master 2×conc.(Roche公司)；核酸提取(离心柱法)试剂盒(达安公司)。

1.3 样品制备和DNA提取 称取样品10 g，剪碎后按1∶4加入去离子水，制成肉浆，取50 μL按核酸提取试剂盒说明书提取DNA。

1.4 引物探针的设计与合成标记 从GenBank上查找并下载猪、鸡、鸭线粒体基因组全序列，参考近年文献发表的相关序列，使用ClustalX软件进行序列比对，筛选出种属相关的保守序列，使用Primer Express软件设计引物探针，交上海辉睿生物科技有限公司合成。序列见表1。

表1 引物探针序列

1.5 多重Taqman-LNA荧光PCR方法的建立 按常规方法分别建立检测猪鸡鸭的单重Taqman-LNA荧光PCR方法。在此基础上组建多重方法，通过优化各引物探针浓度和退火温度，验证方法的特异性和检测限，最后确定多重方法的反应体系为20 μL，其中Probes Master 2x conc溶液10μL，猪、鸡、鸭的引物终浓度分别为0.6 μmol/L、0.3 μmol/L、0.8 μmol/L，探针终浓度分别为0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4μmol/L，DNA模板2 μL。反应条件为95 ℃ 8 min；95 ℃ 8 s，59 ℃ 25 s，40个循环。

1.6 对市售肉制品的检测及阳性结果的验证 用多重方法对市售肉制品进行检测，同时采用SN/T 2051-2008，SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013对检出动物源性成分与标签不符样品进行检测验证。

2 结果

2.1 特异性试验 与从牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、驴、兔等动物肌肉提取的DNA的试验结果，相应荧光通道仅与对应的肉种出现特异性扩增，与其他肉种无典型扩增。

扩增产物经送上海辉睿生物科技有限公司测序，结果与预期相符。

2.2 敏感性试验 多重方法对猪、鸡、鸭的检测限均达到肉含量的0.001%。结果见表2。扩增曲线和标准曲线详见图1。

表2 多重Taqman-LNA荧光PCR方法敏感性试验结果

注：*敏感性试验为3次重复试验；**3次重复Ct<35，且有典型扩增曲线

图1 多重Taqman-LNA荧光PCR敏感试验扩增曲线及标准曲线

注：扩增曲线从左到右分别为肉含量100%～0.0001%。平线为阴性对照

2.3 对市售样品的检测结果及对阳性结果的验证 共检测市售样品170份，检出标签标示以外肉种成分的样品共42份，其中猪肉和鸭肉各19份，同时检出猪、鸡、鸭肉2份，详见表2。样品不合格率为24.7%。从表2可看出，猪肉和鸭肉是主要的掺假肉种，从肉种看，掺假频率较高的样品为牛羊肉制品；从加工方式看，掺假频率较高的样品为丸类制品和调味较重的肉制品。

对检出肉种成分不符的42份样品，分别采用SN/T 2051-2008 ，SN/T 2978-2011 和SN/T 3731.5-2013对其中的猪、鸡、鸭源性成分进行检验确证，结果除1份香酥牛肉丁和1份麻辣牛肉未检出鸭源性成分，与多重方法检测结果不符外，其余检验结果与多重方法一致，多重方法的检测结果与标准方法的符合率为95.5%。

表2 市售肉制品检测结果

3 讨论

本试验建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法能同时检测肉制品中的猪、鸡、鸭源性成分，具有良好的特异性和敏感性，多成分同步检测既节约试剂、耗材，降低检测成本，又节省时间，快速便捷。与何玮玲等[13]应用多重 PCR 同时鉴定猪、牛、羊、鸡相比，操作更简便，也更快速安全，既无需电泳和触毒，还可免去对扩增产物的测序证实。与现行标准方法相比，本多重方法显著提高了检测效率和检测通量，可满足打击肉制品掺假执法的需要。

关于动物源性成分的鉴别已有很多研究报道，其中，Taqman-LNA荧光PCR方法以稳定、准确、快速、无需触毒等优势而得到越来越广泛的应用，然而，在探针设计时，需要通过较长的探针序列来获得较高的Tm值，在设计多重反应时，常常会因此难以找到理想的探针序列。Taqman-LNA荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，通过提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性[14]。本试验利用Taqman-LNA探针的上述优点，设计了序列较短，但特异性较强的Taqman-LNA探针，实现了多肉种同步检测。

以往的荧光PCR仪如Roche，LightCycler®480，由于相邻荧光通道存在一定波长的交叉而产生相互荧光干扰，虽然通过建立颜色补偿曲线等技术处理，可在一定程度上消除相邻通道的荧光干扰，但遇到弱反应时，效果可能不尽理想，加上增加了操作步骤和试剂耗材，使多重荧光PCR的应用受到了制约。本试验采用新一代的荧光PCR仪BIO-RAD， CFX96，由于相邻通道没有波长交叉，因此，进行多重反应时不会产生荧光干扰，无需任何技术处理，其检测限与单重反应没有明显区别。

对市售肉制品检测发现，肉制品掺假依然存在，比例尚不低，甚至某大品牌企业也参与其中。虽然以低价肉代替高价肉的安全风险不高，但存在欺诈行为。一些企业钻了标签标准和目前肉制品中肉含量尚无定量检测标准的空子，利用肉制品的多肉种成分，以高价肉作为品名，而实际却以低价肉为主打肉，这应引起监管部门和标准制定者的关注，建议在对标签标准修订时，应明确标签列明肉含量，并仅限以主肉种作为品名。而检验检测机构应加快肉制品中肉含量的定量检测研究，尽快制定肉含量定量检测标准。

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