猪繁殖与呼吸综合征疫情与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型的相关性研究

马晶晶, 高俊锋， 吴碧清， 韩相敏， 李桃梅， 赖 志

(1.上海创宏生物科技有限公司 ， 上海 松江 201619 ； 2.上海伊科拜克兽药销售有限公司 ， 上海 长宁 201101)

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 是一种严重影响全球养猪业的重要病原，可给养猪生产造成巨大经济损失，所致疫病为猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)，在我国俗称“猪蓝耳病”，以母猪繁殖障碍和生长猪的呼吸道疾病为特征[1]，主要表现为母猪发热、厌食和早产、流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，新生及断奶前仔猪高死亡率[2-3]。

PRRSV为单股正链RNA病毒，约15 kb，有9个开放阅读框，极易变异和演化，呈现毒株的多样性与致病性[4]，特别是高致病性毒株和流行新毒株的不断出现，以及猪场PRRS活疫苗的不正确使用，使疫病的局部暴发和再流行趋势蔓延。PRRSV 基因组的变异主要集中于非结构蛋白 Nsp2编码区、结构蛋白ORF5和ORF3基因；结构蛋白ORF7则是相对保守的区段[5]。本试验旨在通过田间试验的临床观察和生产统计结合分子生物学方法分析猪场PRRSV疫情与猪群存在PRRSV基因型的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验猪场 某南方养殖场生产3线，生产母猪900头。2014年5月开始出现产房母猪高烧、流产和产不合格仔猪(不合格仔猪指死胎、木乃伊胎和弱仔，弱仔标准：初生个体重<0.7 kg)。平均胎产不合格仔猪数为2.45头/窝。6月份母猪流产增加，达18窝/周。对猪场使用蓝耳病疫苗情况进行调查发现：自2012年先后使用过V2332活疫苗、JXA-1R株活疫苗、自家苗(灭活疫苗)。目前，使用TJM-F92株活疫苗。

1.1.2 主要试剂 泰万菌素，购自浙江伊科拜克动物保健品有限公司；病毒基因组提取试剂盒，购自北京天根生物科技有限公司；PCR试剂耗材，购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据猪瘟病毒(CSFV)、细小病毒(PPV)、圆环病毒2型(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组设计诊断引物；根据PRRSV NSP2区段的基因序列特征设计鉴别引物，退火温度和扩增片段见表1。

1.2.2 PCR或RT-PCR检测 取胎衣、脐带血和流产胎儿肺等病料，按照试剂盒说明书提取病毒DNA和RNA，RNA反转录为cDNA。取提取的DNA和反转录的cDNA用PRRSV、细小病病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟引物进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 检测引物序列

1.2.3 用药 在试验猪场饲料中添加泰万菌素进行饲喂，用药时间和剂量见表2。

表2 试验用药方案

1.2.4 生产数据记录 从用药前14 d至用药后98 d，以7 d为周期，对母猪流产数、胎产不合格仔猪数、胎产全死胎、木乃伊胎母猪数和保育舍死淘仔猪数等生产数据进行统计。

1.2.5用药后不同类型毒株PRRSV检测 按表3所示，采样方案分别采集胎衣、脐带血、流产胎儿肺等病料和血清，分别按照试剂盒说明书提取病毒RNA，反转录为cDNA，用PRRSV鉴别引物进行扩增，记录病料和血清中PRRSV经典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例，并分析所有检测项目中经典PRRSV经典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例。

表3 试验采样方案

2 结果

2.1 流产原因诊断结果 通过对病料组织及血清PCR检测，检测结果细小病病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均为阴性，PRRSV为阳性。从而可以判定PRRSV是引起这次流产的主要病原。

2.2 流产母猪统计结果 用药后，流产母猪数从用药前的18头/周下降至用药后7 d的2头/周，21 d降至0头/周(见图1)。

2.3 胎产不合格仔猪数统计结果 用药前母猪胎产不合格仔猪数在2.24～2.45头/胎，用药时为3.63头/胎；随着用药时间推移，胎产不合格仔猪数逐步下降，到用药35 d时下降至1.32头/胎；用药84 d时降为0.78头/胎(见图2)。

2.4 胎产全死胎、黑胎母猪数统计结果 用药前胎产全死胎、木乃伊胎母猪数为4～7头，用药后35 d降为0，并持续到试验结束(见图3)。

2.5 保育死亡淘汰猪数量统计结果 用药前14 d保育死亡淘汰猪为47头，用药后21 d降为17头，随后一直稳定在10～20头之间，直至试验结束(见图4)。

2.6 RT-PCR检测试验结果

2.6.1 所有样品RT-PCR检测结果 从用药前至用药后90 d， PRRSV总阳性率从85.7%下降至14.3%；经典毒和野毒阳性率均逐渐下降，至用药后70 d检测结果均为阴性；PRRSV疫苗毒株从42.9%下降至14.3%。高致病性野毒阳性率趋势图见图5，毒株比重趋势图见图6。PRRSV疫苗毒株经鉴定为蓝耳病疫苗毒株天津株。见图5、6、7。

图1 用药前后流产母猪统计

图2 用药前后胎产不合格仔猪统计

图3 用药前后胎产全死胎、黑胎母猪数量统计

图4 用药前后保育猪死淘数统计

图5 所有样品各批次野毒阳性率趋势

图6 所有样品各批次毒株比重趋势

图7 病料和血清毒株PRRSV鉴别诊断RT-PCR扩增

1：20140905病料样品 ； 2：20140905血清样品 ； 3：PRRSV天津株 ；N：阴性对照 ； M：DL-2 000 DNA Marker

2.6.2 血清、病料样品RT-PCR分检测结果 用药前血清样品中总阳性率为42.9%，用药后30 d为2.9%，随后趋于稳定；经典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒在用药后30 d阳性率≤2.9%。

用药前病料样品中总阳性率为42.9%，用药后≤28.6%；经典毒、高致病性野毒在用药后50 d至试验结束时均≤5.7%；高致病性疫苗毒在用药后阳性率无显著变化，见图8。

图8 病料、血清样品RT-PCR检测结果

3 讨论

近年来，在免疫过PRRSV的猪场仍暴发PRRS的报道呈增加趋势，给猪场带来了很大的经济损失。研究发现，表明PRRSV的重组或变异与各类型PRRSV的种类及病毒血症周期长短有一定关系[8]。

本试验选择在免疫过多种疫苗，而母猪仍出现高烧、流产和产不合格仔猪的猪场进行。检测发现，该猪场存在PRRSV经典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒3种毒株亚型。有研究报道，泰万菌素对PRRSV有抑制作用[6-7]，本试验对母猪饲喂泰万菌素后，PRRSV毒株亚型数减少，同时母猪流产数、胎产不合格仔猪数、胎产全死胎、木乃伊胎母猪数和保育舍死淘数均呈下降趋势，逐渐趋于平稳，表明猪群感染PRRSV基因类型越单一，猪群越平稳。

PRRSV的变异性会导致致病性增强的新毒株出现，一旦成为优势毒株将造成PRRS的暴发。新近的研究表明，从一些发生PRRS的猪场分离到与 HP-PRRSV减毒活疫苗病毒高度同源的毒株，且分离毒株呈现对猪的致病性增强，为这一现象提供了有力的证据[9]。目前，我国 PRRSV减毒活疫苗应用广泛，疫苗病毒的回复突变和毒力返强以及与野毒株重组的现象成为猪场新的PRRS防控难题。因此，在防控PRRS时，活疫苗种类不可盲目贪多，减毒活疫苗的合理使用十分必要[11]，这不仅有利于有效阻止疫苗病毒的演化和毒力回复返强，而且可降低疫苗病毒与野毒重组而产生新毒株的几率，并延缓 PRRSV变异和演化的速度[8, 10]。

[1] Karniychuk U U, Nauwynck H J. Pathogenesis and prevention of placental and transplacental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection[J]. Vet Res, 2013, 44: 95-108.

[2] 贾德清, 李祥健, 刘有昌, 等. 猪繁殖与呼吸综合征的流行病学与防制措施[J]. 兽医导刊, 2009(5): 29-31.

[3] 杨汉春. 猪繁殖与呼吸综合征[M]. 北京: 中国农业出版社, 2015: 176-189.

[4] Chaikhumwang P, Tantituvanont A, Tripipat T,etal. Dynamics and evolution of highly porcine reproductive and respiratory syndrome virus following its introduction into a herd concurrently infected with both types 1 and 2[J]. Infect Genet Evol, 2015, 30: 74-164.

[5] 刘建奎, 魏春华, 戴爱玲, 等. 福建地区猪繁殖与呼吸综合征ORF7基因遗传变异分析[J]. 中国兽医杂志, 2015, 51(10): 17-23.

[6] 陈忠波. 几种大环内脂类药物及其应用[J]. 养殖技术顾问, 2009(09)：188.

[7] 马德慧, 徐兵, 王平. 大环内酯类抗生素-泰万菌素研究综述[J]. 养殖与饲料, 2003, 10: 35-37.

[8] Jiang Y, Xia T, Zhou Y,etal. Characterization of three porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from a single swine farm bearing strong homology to a vaccine strain[J]. Vet Microbiol, 2015, 179: 49-242.

[9] 张元进. 种公猪应慎用蓝耳病疫苗[J]. 养猪，2009(1): 4.

[10] 杨汉春, 周磊. 猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异与演化[J]. 生命科学, 2016, 28(3): 325-336.