水生甲壳类几丁质酶类基因家族功能与表达调控的研究进展

李旭光，周刚，周军，林海，李跃华，陆全平，付龙龙，张云贵

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

水生甲壳类几丁质酶类基因家族功能与表达调控的研究进展

李旭光，周刚，周军，林海，李跃华，陆全平，付龙龙，张云贵

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

水生甲壳类几丁质酶类是分解几丁质外骨骼，消化几丁质类食物的关键酶类，在水生甲壳类的蜕皮生长与营养代谢过程中起着重要作用。文章重点从水生甲壳类几丁质酶类基因的结构特征、时空分布、功能作用、内源与外源调控等方面进行概述。

水生甲壳类；几丁质酶基因；表达调控

几丁质又称甲壳素，是仅次于纤维素的第二大天然多糖，广泛存在于细菌、昆虫和甲壳类动物之中，也是甲壳类外骨骼的主要组成成分。几丁质的降解与合成是甲壳类顺利完成蜕皮，进行生长发育的重要生理过程[1-2]。几丁质酶系广泛存在于微生物、植物、昆虫以及甲壳类动物等体内。根据氨基酸序列的同源性几丁质酶系分为18和19两个家族[3]。18家族广泛存在于微生物、昆虫、甲壳类和哺乳动物中，而19家族多存在于植物中，广泛分布于植物茎、叶、种子及愈伤组织中的几丁质酶类在受到外界因素刺激如病原侵染后植物体内的几丁质酶类的活性迅速增强，表明几丁质酶类具有保卫植物体的重要功能。而在哺乳动物（人类）体内表达的几丁质酶类主要参与T细胞调控的免疫应答调控以及过敏反应等重要的生理过程，其中一些不含有谷氨酸催化保守区域GH18家族蛋白可能还具有凝集素的功能作用[4]。

在昆虫和甲壳类动物体内，几丁质酶系是水解外骨骼几丁质的关键酶类，与机体的蜕皮生长、变态发育、营养代谢、免疫病害防御等重要生理功能密切相关，对应的几丁质酶基因也是一个多基因家族[5-6]。昆虫生长发育过程中要周期性的蜕去旧表皮和换掉围食膜主要依赖于昆虫体内的几丁质酶基因家族。目前已在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、东亚飞蝗（Locusta migratoria）发现23、17、16和7个几丁质酶基因，归属8个不同组类基因家族[7-10]。其中一些几丁质酶在蜕皮液发现，涉及到外骨骼的分解代谢以及蜕皮周期过程；一些肠道中发现，与几丁质食物的营养消化有关；一些几丁质酶涉及变态发育过程中的腹部收起与鞘翅展开。昆虫几丁质酶基因家族多样化可能与几丁质的不同类型以及不同形态结构需要不同的几丁质酶催化作用有关[11]。与昆虫等其他生物几丁质酶系的基因家族调控与病害防控应用相比，甲壳类几丁质酶尚处于单个或多个几丁质酶基因的克隆发现与功能分析水平，研究尚属薄弱，主要集中在组织特异性表达、蜕皮周期变化规律、内源性激素调控、外源性污染物干预影响以及免疫防控等方面[12-14]。

1 水生甲壳类几丁质酶基因的结构特征

Watanabe等[15]首次在甲壳类动物日本囊对虾（Marsupenaeus Japonicus）的肝胰脏组织中发现了几丁质酶基因Pjchi-1，从而开启了研究水生甲壳类几丁质酶基因家族的序幕，此后陆续在其他虾蟹类动物发现多个几丁质酶基因。随着重要甲壳类模式生物转录组与基因组的测序完成，甲壳类几丁质酶基因家族的几丁质酶基因的发现越来越多。目前在水生甲壳类中发现的三十几种几丁质酶类基因，主要集中在具有重要经济价值的十足目虾蟹类中[16-22]，包括长尾派类的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（Marsupenaeus Japonicus）、日本仿长额虾（Pandalopsis japonica）和短尾派类锯缘青蟹（Scylla serrata）、三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）等。

对已分离获得的水生甲壳类几丁质酶基因蛋白的结构研究发现，水生甲壳类几丁质酶是一个多基因家族，具有典型的18家族几丁质酶特征，一般包括N端的活性催化区、C端富含半胱氨酸的几丁质结合区以及连接这两个区域、富含脯氨酸、谷氨酸的连接区。水生甲壳类同一几丁质酶基因家族中的不同几丁质酶的结构也有所不同。在同一水生甲壳类动物体内一些在外表皮组织几丁质酶类具有完整的催化区、结合区和连接区，主要涉及到外骨骼的分解代谢；而一些在肝胰脏组织几丁质酶类仅具有催化区，缺少几丁质结合区与连接区，主要涉及几丁质类食物的消化分解。缺少几丁质结合区的几丁质酶类仍旧具有分解几丁质的能力，但是由于缺少几丁质结合区与底物的结合，其分解几丁质的活性要低于具有几丁质结合区的几丁质酶类。

2 水生甲壳类几丁质酶基因的组织分布

甲壳类几丁质酶基因家族中的几丁质酶基因在不同组织中的分布表达具有明显的组织特异性，其中一些几丁质酶基因仅在某一组织中被检测到，而另一些几丁质基因在多个组织中被发现。Huang等[16]在研究南美白对虾几丁质酶基因的组织表达发现，几丁质酶基因LvChi-5和LvChiD1在肝胰脏、肠、外表皮、鳃、眼柄、心脏、肌肉、血细胞组织均能检测到，LvChi-6主要在外表皮、鳃和眼柄组织中表达，LvChi-1、LvChi-3和LvChi-4仅在肝胰脏组织表达，LvChi-2主要在眼柄组织中表达。Proespraiwong等[17]报道了斑节对虾几丁质酶基因PmChi-1和PmChi-3主要在肝胰脏组织表达，而PmChi-2主要在外表皮组织表达。Salma等[19]报道了日本仿长额虾几丁质酶基因PjChi-1，PjChi-3A、PjChi-3B、PjChi-3C和PjChi-4主要在肝胰脏和肠组织表达，而PjChi-2主要在外表皮组织表达。在蟹类方面，锯缘青蟹几丁质酶基因SsChi-1和SsChi-4在肝胰脏和鳃组织中均高表达，SsChi-3仅在肝胰脏组织中专一表达，SsChi-2在鳃组织和外表皮组织中表达。肝胰脏与外表皮组织是甲壳类几丁质酶高表达的重要组织，进一步研究表明肝胰脏、肠组织表达的几丁质酶可能主要与降解含几丁质类食物及营养吸收有关，而在外表皮组织表达的几丁质酶基因主要与外骨骼生理性周期蜕皮密切相关。

3 水生甲壳类几丁质酶基因在蜕皮周期过程的表达规律

甲壳类几丁质酶基因在周期性生理蜕皮过程的表达变化显著。Watanabe等[23]首次在虾类中发现在外表皮组织特异性表达的几丁质酶基因PjChi-2在日本囊对虾蜕皮前期显著增大，而蜕皮间期表达水平显著降低。而Zou等[24]也在蟹类中报道了分布于外表皮与肝胰脏组织的几丁质酶活性在蜕皮前期（D1-4）的表达丰度显著高于蜕皮后期（A/B）、蜕皮间期（C）的表达水平。水生甲壳类几丁质代谢酶基因的表达丰度与血液组织中的蜕皮激素浓度的变化趋势具有一致性。在蜕皮间期（C）蜕皮激素浓度与几丁质酶类活性处于基线水平，当进入蜕皮前期（D0），蜕皮激素浓度与几丁质酶活性开始升高，到蜕皮前期（D1-2）达到峰值，进入蜕皮前期（D3-4）蜕皮激素含量和几丁质酶活性达到最高值，到蜕皮后期（A-B）蜕皮激素浓度与几丁质酶活性又降回到正常水平[25]。然而也有一些报道甲壳类代谢酶基因在蜕皮周期过程的表达趋势与血液中的蜕皮激素浓度变化相反。Rocha等[14]在研究南美白对虾几丁质酶基因LvChi-2在蜕皮周期的变化趋势发现，几丁质酶基因LvChi-2在蜕皮间期到蜕皮前期过程中其表达丰度提高了15倍，而到达蜕皮前期（D1-3）期间几丁质酶表达水平在基线附近，这与之前甲壳类几丁质酶基因的表达趋势有所不同。

4 水生甲壳类几丁质酶类的生物学功能

近年来利用RNA干扰技术使靶基因沉默成为直接研究几丁质酶基因在蜕皮周期过程功能作用的重要手段[11]。通过向不同生长发育阶段的Tribolium castaneum注射dsRNA直接导致几丁质酶类基因的表达沉默，当几丁质酶TcCHT10表达沉默后，T.castaneum在幼虫、蛹以及成虫阶段均无法正常完成蜕皮过程而死亡，表明几丁质酶基因Tc－CHT10是幼虫、蛹阶段蜕皮以及成虫蜕皮生长过程中所必需的功能基因。而当注射dsRNA下调Tc－CHT5表达时，T.castaneum虽然都能够顺利完成幼体、蛹阶段的蜕皮生长过程，但最终都在蛹向成虫的变态发育5～6 d后死亡，表明几丁质酶基因Tc－CHT5是T.castaneum从蛹阶段向成虫阶段变态蜕皮的关键酶类。李大琪等[10]利用RNAi干扰技术直接抑制外表皮组织中几丁质酶基因LmCht6表达，通过向机体内注射dsRNA下调LmCht6后发现，东亚飞蝗蜕皮过程中新表皮与旧表皮无法正常完全分离而最终导致死亡。这些研究进一步证明了几丁质酶基因在其蜕皮周期过程中起着关键性作用，当几丁质酶基因的表达受到抑制沉默后，生物体无法有效降解旧骨骼顺利完成蜕皮发育过程，而导致其死亡。

5 内源性激素对水生甲壳类几丁质酶基因的表达调控

几丁质酶类是甲壳类体内多种激素通过信号通路网络调控完成生理性周期蜕皮过程的终端产物，与激素的调节密切相关[26-27]。通过对上游端蜕皮类激素的信号通路的调控干预将会影响到下游几丁质代谢酶类基因的表达以及酶活性。当前已开展了蜕皮激素、蜕皮抑制激素、蜕皮激素受体等上游激素对几丁质酶基因表达及酶活性影响的研究。蜕皮激素是最早被发现对几丁质酶基因的表达具有调控作用的激素。在甲壳类体内几丁质代谢酶基因的表达丰度及酶活性变化趋势与蜕皮激素含量变化规律存在一致性；而通过向甲壳类体内注射蜕皮激素能够引起机体外表皮和肠组织中的几丁质代谢酶基因的表达丰度显著升高，几丁质酶活性增强[28，20]。蜕皮激素受体和维甲酸受体是位于甲壳类蜕皮周期过程中信号通路级调控的上游端，亦是参与调控几丁质酶基因的关键基因。Priya等[13]开展了中国对虾蜕皮激素受体对几丁质酶基因表达的调控研究，当向虾体内注射dsRNA后，几丁质酶基因的表达也显著下调，表明蜕皮激素受体基因参与激素调控级联放大反应，对几丁质酶的表达具有明显的调控作用。蜕皮抑制激素是属于甲壳类高血糖激素家族神经肽，主要由位于眼柄X-器官分泌。Pamuru等[29]通过切除眼柄、注射蜕皮抑制激素dsRNA和注射蜕皮激素三种方法分析对红螯龙虾（Cherax quadricarinatus）几丁质酶基因的影响，其中切除眼柄比注射MIH dsRNA和注射蜕皮激素更能有效激活几丁质代谢酶类分解几丁质，缩短甲壳类蜕皮周期时间。而对于蜕皮抑制激素浓度变化对不同组织几丁质酶基因的促进或抑制作用具体机制还不清楚。

6 外源性环境污染物对水生甲壳类几丁质酶基因的表达影响

随着工农业与渔业的发展，水生环境受到越来越多的环境污染物污染，许多环境污染物通过食物链的传递与浓缩作用，在水生甲壳类体内迅速蓄积放大，干扰水生甲壳类的内分泌调控网络，进而影响正常的蜕皮发育过程，甚至导致其死亡。环境污染物通过影响甲壳类内蜕皮激素的合成和释放或竞争Y器官蜕皮激素受体等方式，干扰蜕皮激素-蛋白调控信号网络，抑制水解蛋白酶特别是几丁质酶类活性，延长了蜕皮周期时间，影响正常蜕皮发生，导致甲壳类无法顺利完成蜕皮死亡。甲壳类外表皮组织中的几丁质酶类是蜕皮调控表达的终端，通过测定外表皮组织的几丁质酶基因的表达变化反应其受污染的影响程度。据报道暴露在多氯联苯、有机氯农药、己烯雌酚、硫丹等环境污染物条件下，招潮蟹外表皮组织的几丁质酶基因的表达以及酶活性均受到显著抑制[30]。当褐对虾（Penaeus aztecus）受到多环芳香烃类的环境污染物影响时，位于外表皮组织中的几丁质酶基因NAG mRNA的表达丰度也受到显著影响[31]。一些内分泌干扰素如与雌激素受体结合的聚氯酮、甲氧氯等杀虫灭菌类药物的使用亦会引起几丁质酶表达活性的下调，进而影响甲壳类的蜕皮过程。

当水生甲壳类受到外源性刺激如病害侵染时，机体几丁质酶基因的表达丰度发生显著变化，表明几丁质酶基因可能直接参与生物体的免疫防控。Zhang[18]报道了日本对虾在受到白斑病毒（WSSV）侵染后几丁质酶基因Pjchi-3表达丰度上调，可能与机体免疫抵抗有关。在中国明对虾肝胰脏组织发现与Pjchi-3直系同源基因Fcchi-3在受到对虾白斑病毒侵染后mRNA丰度升高，表明几丁质酶基因Pjchi-3与Fcchi-3可能在对虾防御抵抗病毒过程中起着重要作用。在其他一些水生动物如南美白对虾（Litopenaeus vannamei）、日本七鳃鳗（Lampetra japonica）、长牡蛎（Crassostrea gigas）也报道几丁质酶基因参与机体的固有免疫反应过程[32]。

7 展望

几丁质代谢酶基因在节肢动物蜕皮生长中的功能作用是近年研究的热点。当前昆虫几丁质酶类研究已经在几丁质酶基因的克隆定位、蜕皮周期的变化规律、RNA干扰功能研究、内源激素调控、环境污染物影响、异源表达及病害防控等方面作了较为深入的研究。而水生甲壳类几丁质代谢酶基因的研究尚属起步阶段，至今没有形成有较为系统的研究，今后仍然需要加强对重要经济虾蟹类的几丁质酶类基因家族的开发，重点关注甲壳类内分泌调控激素（蜕皮激素、蜕皮抑制激素、蜕皮激素受体等）对下游端终端产物几丁质酶类的调控机制，外源性环境污染物对甲壳类几丁质酶基因家族的干预抑制路径及污染程度分析，几丁质酶体外异源高效表达以及在甲壳类养殖生产中的同步化蜕皮生长应用等方面研究。

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Research progresses in function and expression regulation of chitinase gene family of aquatic crustaceans

Li Xuguang，Zhou Gang，Zhou Jun，Lin Hai，Li Yuehua，Lu Quanping，Zhang Yungui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Chitinases，a multi-gene family，are crucial enzymes involved in digestion of chitinous food and degradation of chitinous exoskeleton in aquatic crustaceans，which play important physiological roles in growth and the nutrition metabolism.In this paper，the structure of chitinases，tissue distribution，expression of the molting cycle，physiological function，endogenous and exogenous regulation and other aspects are reviewed.

Aquatic crustaceans；chitinase gene；expression regulation

S966.16

A

004-2091（2017）04-0026-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.006

2016-10-18）

江苏省自然科学基金项目（BK20161602）、江苏省农业自主创新[CX（15）1011]、江苏省水产三新工程（D2015-5、D2016-1）

李旭光（1981-），男，助理研究员，主要从事水生甲壳类研究.E-mail:xuguangli1981@163.com

周刚（1962-），男，研究员.E-mail:zhougang2003@hotmail.com