STED超高分辨显微成像技术原理及其在医学研究中的应用

郭大伟张四洋

STED超高分辨显微成像技术原理及其在医学研究中的应用

郭大伟1张四洋2

受激发射损耗（STED）超高分辨率成像技术是一种突破光学衍射极限的显微镜技术，可以达到纳米级分辨率，适合于对200 nm以内的细胞细微结构进行观察和分析。STED技术的优势包括超高分辨率、快速扫描、多色观察、活细胞监测、厚组织标本3D重建、共定位分析等，是现代医学和细胞生物学研究的理想工具。目前STED技术成功实现了对于荧光纳米颗粒的成像，更多的亚细胞结构细节以及活细胞器的生理活动可以被STED技术解析出来，得到了越来越广泛的应用。文章主要介绍了STED超高分辨率成像技术的主要原理及其在医学细胞生物学研究领域的主要应用。

STED技术；工作原理；医学细胞生物学；应用

18世纪70年代，德国物理学家Ernst Abbe发现，可见光由于其波动性会发生衍射。由于衍射的限制，一个物点经光学系统成像，不可能得到理想的像点，而是得到一个衍射像，每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了光学系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这是物理光学的限制，是由于光的衍射造成的。根据这个Abbe定律，可见光能分辨的最小直径是200 nm。几个世纪以来，200 nm的衍射极限（Abbe极限）一直被认为是光学显微镜理论上的分辨率极限，小于这个尺寸的物体必须借助电子显微镜或隧道扫描显微镜才能观察。几个世纪以来，光学显微镜的衍射极限一直被认为是无法超越的。现在科学家们从不同途径突破了这一极限，使人们能够分辨相距小于200 nm的两个物体。这类技术被统称为超高分辨率显微技术或纳米显微技术（nanoscopy）。德国Max-Planck学会生物物理化学研究所所长Stefan W. Hell，凭借发明突破200 nm衍射极限的STED（stimulated emission depletion）超高分辨率光学显微镜[1]，与Eric Betzig和William E. Moerner一起获得了2014年诺贝尔化学奖，以表彰他们为发展超高分辨率荧光显微镜所做出的贡献。STED荧光成像技术是一种分辨率突破衍射极限的强大显微成像技术，在医学细胞生物学研究领域越来越显示其重要性，目前主要用于分辨生物标本纳米级别的细节，观察活细胞中亚细胞器的运动特性及变化。

1 STED技术原理

1.1 原理

STED技术基于受激发射（stimulated emission）现象，理论上具有无限分辨率。激光共聚焦显微镜激发时具有衍射极限区域，此区域的大小决定了分辨率，因此减小衍射极限区域的面积在理论上可以提高分辨率。当特定的荧光分子被长于其激发波长的激光照射时，可以被强行淬灭回到基态。用一束激发光使荧光分子（化学合成或荧光蛋白）发光的同时，再用另外一束高能量脉冲激光器发射“面包圈”样环状的波长较长的激光，将第一束发射光光斑中的“面包圈”部分通过受激发射损耗过程淬灭，而“面包圈”中心光斑的荧光保留成像，从而减少发射光荧光光斑的衍射面积，提高图像的分辨率。在这一过程中，必须确保损耗激光集中并环绕中心光斑，否则所有的荧光分子都会受影响而且不能成像。剩余光斑的大小取决于激发光照射区域与淬灭环宽度的比值、衍射参数如波长和数值孔径，以及照射至该环状焦点处的能量大小，即损耗激光的能量。STED技术不受光衍射的限制，即突破了衍射极限，使用户可以在纳米水平上进行亚细胞结构和动力学的研究。

1.2 STED技术的优势

STED技术具有很多优势，包括超高分辨率、快速扫描、多色观察、活细胞监测、厚组织标本3D重建、共定位分析等，是现代医学和细胞生物学研究的理想工具。STED技术是以纯光学方法提高图像分辨率，并实时成像，进行定位研究时不需要经过后期计算机软件对大量图片进行处理，原始数据就是图像。对于活细胞或活组织成像具有较高的扫描速率，可以完成生理学相关实验。此外多种荧光染料结合使用，可同时观察多个荧光信号，实现精确的共定位分析。

1.3 使用STED超高分辨率成像技术需要注意的问题

对于研究细胞器或细胞膜内部的细胞生物学家来说，大多数需要观察的生物活动发生在低于200 nm分辨率的水平上，在使用STED技术成像时，应该特别注意一些问题。比如需要了解与使用的荧光标记分子的波长相匹配的STED损耗波长。对100 nm以内的标本成像时，荧光蛋白的过表达可能会使成像出现偏差，激光强度也会对标本产生影响。如果想要获得20 nm分辨率，图像像素大小至少要在10 nm左右。激光共聚焦显微镜可以接受较低的标记密度，但STED成像对标本染色有更高的要求，必须有较高的荧光标记强度。例如，用激光共聚焦显微镜对微管成像，即使荧光标记密度不是很高，衍射极限的存在也会使微管成像看起来是连续的。但如果采用STED技术成像，荧光标记强度不是很高，那么微管可能成像后不是连续的结构，这会使研究人员对一种未知结构的认识产生假象。“怎么确定图像是真实的？能控制哪些条件以便不会被显微镜的假象所误导？”，在进行超高分辨率成像时，应当时刻提醒自己注意图像的真实性，想办法设置正确的对照，比如利用电镜和抗体对结果进行验证。对于活细胞而言，任何用荧光分子标记的方法都有可能改变细胞的生物学状态，因此研究人员应该结合活细胞和固定细胞的观察，以确保在超高分辨率显微镜下观察到的结构是真实的[2]。

2 STED技术的主要应用

2.1 研究蛋白质定位及功能

Atto647N标记的转铁蛋白纳米颗粒，具有很好的生物相容性、胶体稳定性及光稳定性，适用于生物学研究。STED技术用于对活细胞中纳米颗粒的结构进行精确成像和定位，发现多个纳米颗粒共同存在于一个内涵体小泡[3]。STED成像揭示了肌浆网终末池中的RyR簇与溶酶体中的TPC2之间非常接近的空间位置关系，二者之间的距离估计为52～87 nm。结果提示局限于TPC2的Ca2+的释放造成更多的Ca2+从肌浆网中释放，促进肌细胞肌原纤维形成[4]。利用STED技术显示含有TGF-β II型受体的高尔基体后小泡，观察到这些含有胞浆中新合成的TGF-β II型受体的小泡为环形结构，其大小在300～1 000 nm左右，而且TGF-β II型受体在小泡外环成簇存在，这些发现为研究TGF-β受体在细胞内的运输及其信号传导过程提供了新思路[5]。

2.2 研究细胞器的活动和功能

STED成像观察亚线粒体结构，与细胞类型和生理状态有关。采用阳离子荧光染料TMRM（tetramethylrhodamine methyl ester），揭示出线粒体层状结构的细节，呈现窗帘样的快速变化。研究人员发现TMRM阳性结构不与任何基质或外膜中的蛋白共定位，而是部分定位于类核区。不与氧化磷酸化系统偶联可以使TMRM从线粒体内膜释放，而不会造成基质结构的改变。利用STED技术观察到电子呼吸链复合体定位于TMRM阳性结构的表面，这些观察结果为体内研究亚线粒体结构及其功能提供新的视角[6]。脂肪的异位沉积如骨骼肌、肝脏、心脏等与代谢异常密切相关。细胞内的脂肪以脂滴的形式储存，被认为是细胞代谢过程中具有活性的细胞器。STED技术可以用来观察、鉴别以及定量细胞内的脂滴。利用脂类探针结合STED成像揭示细胞内脂类的功能和动力学变化，用于脂类生化及病理生理学方向的研究[7]。动态的生物传感器结合STED技术，利用H2O2荧光传感器HyPer2，得到微丝的超分辨图像，同时通过监测探针的荧光强度可以追踪活细胞内H2O2的产生[8]。

2.3 厚组织标本的成像

在纳米级水平对细胞内的结构进行成像和定位是医学细胞生物学研究面临的主要问题。对发育及成熟过程中小鼠原代海马神元的研究，通过STED技术进行3D重建，发现TGF-β2促进KCC2与Rab11b的共定位及其相互作用，诱导CREB磷酸化，并增加Rab11b蛋白表达，从而证实TGF-β2是介导KCC2膜转运、表达于细胞表面并发挥活性功能的新的调控因子[9]。利用STED技术清晰的显示出直肠腺癌组织切片中HER2在细胞表面和细胞内的分布情况，可以充分利用保存的石蜡包埋组织标本进行回顾性研究，去发现纳米级蛋白质的未知领域[10]。为了研究神经元突触的功能，研究人员必须深入脑组织深层进行无损伤的三维立体成像。利用STEM技术对actin在树突和轴突中的不同分布进行解析，分辨率达到60～80 nm，可观察的体外培养的脑组织薄片深度达到120 μm。而且，time-lapse STEM成像观察到actin结构的变化，表明是由神经元的活性调节的。结果表明无损伤的脑组织，在纳米水平上观察actin变化动力学，有助于深入研究突触的功能[11]。

2.4 细胞外小泡（EVs）的研究

STED技术能够达到的分辨率大约为50 nm，适合检测一般EVs的大小及表面荧光标记抗原的分布，可以显示单个EVs[12]。利用荧光标记抗体检测EVs表面标记，显示NK细胞和血小板来源的EVs缺乏CD9或CD81的表达，活化的B细胞来源的EVs构成了不同的EVs亚群。细胞外不同的EVs还可以通过磁珠分选的方法分离纯化再进行分析。STED技术用于以前不能区分的EVs亚群及其功能是非常有力的工具[13]。

2.5 核酸分子成像

STED技术不仅可以观察蛋白相互作用，也可以用于核酸水平的研究。利用STED技术在原代培养的单个海马神经元细胞中定位特定的mRNA，具有较高的空间分辨率。采用FISH和免疫荧光染色同时对一个标本中的mRNA和蛋白进行检测，包括3个非常重要的突触前蛋白（突触小泡蛋白、突触结合蛋白、突触素）。STED技术可以将mRNA水平和定位的变化与神经元细胞的生理活动和发育过程相联系，从而帮助研究人员监测调控mRNA分布和动力学变化的分子机制[14]。染色质的结构非常复杂，特别是对活细胞中10～200 nm范围内DNA分子的研究非常受限。超高分辨率显微成像技术则可以帮助研究人员观察到不同凝集阶段的亚染色质结构，如高度致密的有丝分裂期染色体以及难以阐释的分裂间期染色质图像，并非常有可能发现染色质中未曾发现的细节特征[15]。

综上所述，STED超高分辨显微成像技术逐渐成为研究人员探索亚细胞器结构和功能的有力工具，用于荧光标记的快速变化的离子水平监测、细胞器生理活动的动态观察、多重免疫荧光标记的定位分析等诸多研究方向，在医学细胞生物学领域的应用越来越广泛。

[1]Balzarotti F，Eilers Y，Gwosch KC，et al． Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes[J]． Science，2017，355（6325）：606-612．

[2]Marx V． Is super-resolution microscopy right for you? [J]． Nat Methods，2013，10（12）：1157-1163．

[3]Shang L，Gao P，Wang H，et al． Protein-based fluorescent nanoparticles for super-resolution STED imaging of live cells[J]．Chem Sci，2017，8（3）：2396-2400．

[4]Kelu JJ Webb SE，Parrington J，et al． Ca2+release via twopore channel type 2 （TPC2） is required for slow muscle cell myofibrillogenesis and myotomal patterning in intact zebrafish embryos[J]． Dev Biol，2017，425（2）：109-129．

[5]Ruan H，Yu J，Yuan J，et al． Nanoscale Distribution of Transforming Growth Factor Receptor on Post-Golgi Vesicle Revealed by Super-resolution Microscopy[J]． Chem Asian J，2016，11（23）：3359-3364．

[6]Ishigaki M，Iketani M，Sugaya M，et al． STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells[J]．Mitochondrion，2016（28）：79-87．

[7]Daemen S，van Zandvoort MA，Parekh SH，et al． Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics[J]．Mol Metab，2015，5（3）：153-163．

[8]Mishina NM，Mishin AS，Belyaev Y，et al． Live-Cell STED Microscopy with Genetically Encoded Biosensor[J]． Nano Lett，2015，15（5）：2928-2932．

[9]Roussa E， Speer JM， Chudotvorova I， et al． The membrane trafficking and functionality of the K+-Cl- co-transporter KCC2 is regulated by TGF-β2[J]． J Cell Sci，2016，129（18）：3485-3498．

[10]Ilgen P，Stoldt S，Conradi LC，et al． STED super-resolution microscopy of clinical paraffin-embedded human rectal cancer tissue[J]． PLoS One，2014，9（7）： e101563．

[11]Urban NT， Willig KI， Hell SW， et al． STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices[J]． Biophys J，2011，101（5）： 1277-1284．

[12]Tønnesen J， Nadrigny F， Willig KI， et al． Two-color STED microscopy of living synapses using a single laser-beam pair[J]．Biophys J，2011，101（10）：2545-2552．

[13]Koliha N，Wiencek Y，Heider U，et al． A novel multiplex beadbased platform highlights the diversity of extracellular vesicles[J]． J Extracell Vesicles，2016，（5）：29975．

[14]Zhang WI，Röhse H，Rizzoli SO，et al． Fluorescent in situ hybridization of synaptic proteins imaged with super-resolution STED microscopy[J]． Microsc Res Tech，2014，77（7）：517-527．

[15]Flors C，Earnshaw WC． Super-resolution fluorescence microscopy as a tool to study the nanoscale organization of chromosomes[J]． Curr Opin Chem Biol， 2011，15（6）：838-844．

The Working Principle of Stimulated Emission Depletion based Super-Resolution Imaging Technology and its Application in Medical Research

GUO Dawei1ZHANG Siyang2
1 The Fourth Department of Surgery,The Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang Liaoning 110032, China; 2 Science Experiment Center of China Medical University, Shenyang Liaoning 110122, China

Stimulated emission depletion based super-resolution imaging technology is a microscopic technique, which breaks the optical diffraction limit with a resolution of nanoscale. It is used for the observation andanalysis of microscopic structures less than 200 nm in cells. The advantages of STED technique include the super-resolution, rapid scanning, multi-color observation, live cells monitoring, 3D reconstruction of thick tissues, and co-localization analysis, which is growing up to be an ideal tool in the field of medical and cell biological research. STED has been successfully applied to take pictures of in fluorescentantiparticle, more and more subcellular details and physiological activities of living organelles can be resolved by STED technology, which is being widely used. This is a brief overviews for the working principle of STED based super-resolution imaging technology and its application in the field of medical cell biology.

stimulated emission depletion super-resolution imaging technology; working principle; medical cell biological; application

R-3

A

1674-9308（2017）18-0202-02

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．18．112

2015年辽宁省自然科学基金项目（2015020739）

1中国医科大学附属第四医院普外四科，辽宁 沈阳110032；2中国医科大学科学实验中心，辽宁 沈阳 110122

张四洋