电针“委中”对腰椎间盘退变模型大鼠椎间盘组织Fas和FasL表达的影响

刘午龙++陈少清++林建平++陈水金++夏梦++王诗忠

摘要：目的 观察电针“委中”对腰椎间盘退变模型大鼠椎间盘组织Fas、FasL表达的影响，探讨其作用机制。方法 30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组，每组10只。假手术组仅手术切开皮肤，模型组和电针组通过纤维环穿刺法建立大鼠腰椎间盘退变模型。成模4周后，假手术组和模型组行等条件固定处理，电针组电针“委中”治疗，20 min/次，每日1次，连续4周。治疗结束后，Western blot、RT-PCR检测Fas、FasL的蛋白和mRNA表达。结果 模型组Fas、FasL蛋白和mRNA表达较假手术组明显升高（P<0.05），电针组Fas、FasL蛋白和mRNA表达较模型组明显降低（P<0.05）。结论 电针“委中”可降低Fas、FasL的表达，起到抑制腰椎间盘退变的作用。

关键词：电针；委中；细胞凋亡；Fas；FasL；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.016

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0063-03

Effects of Electro-acupuncture at “Weizhong” （BL40） on Expressions of Fas and FasL in Rats with Lumbar Disc Degeneration LIU Wu-long1， CHEN Shao-qing1，2， LIN Jian-ping2， CHEN Shui-jin3， XIA Meng3， WANG Shi-zhong1 （1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Rehabilitation Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China； 3. Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology， Fuzhou 350122， China）

Abstract： Objective To observe the effects of electro-acupuncture （EA） at “Weizhong” （BL40） on expressions of Fas and FasL in rat models with lumbar disc degeneration； To discuss its mechanism of action. Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham-operationgroup， model group and EA group， with 10 rats in each group. The sham-operation group was treated with sham operation to incide local skin； the model and EA groups established rat model of lumbar disc degeneration by puncturing the annulus fibrosus. Four weeks after modeling， rats in the sham-operation and model groups received fixed treatment under identical condition， and rats in the EA group were treated with EA at “Weizhong” （BL40） in 20 minutes， once a day， for 4 weeks. After treatment， Western blot and RT-PCR technology were used to test the protein and mRNA expression levels of Fas and FasL. Results The expressions of Fas and FasL in the model group were higher than those in the sham-operation group （P<0.05）； protein and mRNA expression levels of Fas and FasL in the EA group were lower than those in the model group （P<0.05）. Conclusion EA at “Weizhong” （BL40） can reduce the expressions of Fas and FasL to inhibit the development of lumbar disc degeneration.

Key words： electro-acupuncture； Weizhong （BL40）； apoptosis； Fas； FasL； rats

腰椎间盘退变易引发腰椎管狭窄、椎体小关节不稳、椎间盘突出、神经根及脊髓受压等病理改变，导

基金项目：国家自然科学基金（81303017）；福建省卫生厅医学创新项目（2014-CXB-20）

通讯作者：陈少清，E-mail：chenshaoqd@163.com

致下腰痛及坐骨神经痛。自1947年Steindler A[1]首次提出腰痛和椎间盘退变相关后，如何延缓椎间盘退变防治腰痛成为了研究的热点。有研究发现，Fas、FasL在退变的椎间盘组织中表达升高，并与细胞凋亡密切相关[2]。临床上应用针刺治疗腰椎间盘退行性疾病疗效较好，委中为改善腰椎间盘退行性疾病的常用穴位[3]，但其作用机制尚未完全阐明。因此，本实验观察电针“委中”对腰椎间盘退变模型大鼠椎间盘组织凋亡因子Fas、FasL表达的影响，探讨电针“委中”治疗腰椎间盘退变的作用机制。endprint

1 实验材料

1.1 动物

SPF级3月龄健康雄性SD大鼠30只，体质量（250±30）g，上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学实验动物中心，室温20～22 ℃，相对湿度45%～55%，12 h明暗交替，自由进食饮水。

1.2 主要试剂与仪器

Anti-Fas（Santa Cruz公司），Anti-Fas Ligand（Abcam公司），Anti-β-actin（Cell Signaling公司）。超低温冰箱（Thermo公司），电泳仪、图像分析系统、PCR仪（BIO-RAD公司），华佗牌无菌针灸针、华佗牌电针仪（苏州医疗用品有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组

实验大鼠适应性饲养1周后，按体质量编号，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组，每组10只。

2.2 造模

参照文献[4]纤维环穿刺法。大鼠仰卧位，取右侧旁正中切口，逐层切开，暴露腹后壁，以髂总动脉分叉处或左右髂嵴作为定位点，将腰大肌和深层肌肉的附着点从椎体附着处钝性剥离，暴露椎间盘，21号穿刺针行纤维环穿刺术（深度1.5 mm），穿刺完成后，缝合处理。假手术组仅切开皮肤后缝合，不作造模处理。造模后每组随机取2只大鼠，HE染色确定模型是否成功：假手术组髓核网状结构完整，纤维环结构排列有序，清晰可辨；模型组和电针组髓核网状结构退化，呈纤维软骨样改变，体积减小，纤维环细胞肿胀甚至断裂，排列紊乱，表明造模成功。

2.3 干预方法

电针组成模4周后，参照文献[5]穴位定位及针刺方法，直刺大鼠“委中”0.5 cm，双极联体电针接电针仪，选择疏密波，频率2 Hz，电流1 mA，以下肢出现轻微颤抖为准，每次20 min，每日1次，连续4周。假手术组和模型组行等条件固定处理。

2.4 取材

干预结束后，所有大鼠10%水合氯醛腹腔注射处死，取整个腰椎椎体（含椎间盘）迅速移至冰面上进行操作，快速取出椎间盘组织，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.5 Western blot检测

称取大鼠椎间盘组织50 mg，加入裂解液，研磨均匀后静置30 min，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA测蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离，通过半干转移法转至膜上，室温封闭1 h，分别加入一抗抗体稀释液中孵育，4 ℃过夜，再用二抗室温孵育1 h，化学发光法显色，Image-lab图像分析系统分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对灰度。

2.6 RT-PCR检测

引物设计：β-actin上游5'-CCACCATGTACCCAG GCATT-3'，下游5'-CGGACTCATCGTACTCCTGC-3'，产物扩增长度为470 bp；Fas上游5'-CTGGCGTGT TCTTTTTGCCA-3'，下游5'-CCAAGACGGTCATCC CTCAG-3'，产物扩增长度为797 bp；FasL上游5'-TCC TGGGGATCTGGTGCTAA-3'，下游5'-GCCTCCTGT GAGGTAGCAAG-3'，产物扩增长度为549 bp。取大鼠椎间盘组织，于液氮中研磨后行总RNA提取，RNA浓度测定，反转录为cDNA，再行PCR扩增。反应条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，共32个循环。PCR产物经凝胶电泳后，进行成像分析，并以β-actin作为内参基因，计算目的基因与β-actin内参基因的相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 电针对模型大鼠椎间盘组织Fas、FasL蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组Fas、FasL蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组Fas、FasL蛋白表达明显降低（P<0.05）。结果见表1、图1。

4.2 电针对模型大鼠椎间盘组织Fas、FasL mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组Fas、FasL mRNA表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组Fas、FasL mRNA表达明显降低（P<0.05）。结果见表2、图2。

5 讨论

前期研究表明，电针治疗不仅能够有效改善疼痛症状，而且在分子生物学研究中对椎间盘退变的机制也有影响[6]。历代古医籍中有许多关于针灸治疗腰痛的记载，“腰背委中求”是中医学治疗腰背部病症循经取穴的经典方法，至今仍在指导临床治疗腰椎间盘退变疾病。委中作为“四总穴”之一，是治疗腰椎退行性疾病的常用效穴，并有“经脉所过，主治所及”的特点。

腰椎间盘退变与腰椎间盘结构的破坏和功能障碍密切相关，这个过程是多种复杂因素相互作用的结果。李小川等[7]发现，在退变椎间盘中，Fas、FasL的蛋白和mRNA表达与正常椎间盘比较，差异均有统计学意义。还有研究发现，退变椎间盘组织Fas和FasL高表达，并且存在明显的细胞凋亡[8-9]。因此，阻断Fas/FasL系统，减少椎间盘细胞的凋亡，可以延缓椎间盘的退变。

对于腰椎间盘退变的凋亡通路，目前研究发现主要有3条途径：一种为Fas/FasL介导的死亡受体途径，也叫外源性途径；一种为线粒体途径，也称内源性途径；还有内质网应激所导致的凋亡[10]。Fas是一种细胞表面受体，它可以与FasL（即Fas的配体）结合，诱导Fas三聚体的形成，继而导致Fas胞内的死亡结构域（DD）与另一种Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）结合，同时，FADD的N端DD与Caspase-8酶原相互作用，从而募集细胞中Caspase-8酶原，使Caspase-8激活，形成由Fas/FADD/Caspase-8组成的死亡诱导信号复合体，从而导致表达Fas的细胞凋亡[10]。endprint

本实验通过电针“委中”进行干预，采用Western blot检测Fas、FasL的蛋白表达，RT-PCR检测Fas、FasL的mRNA表达。实验结果显示，电针“委中”可以改善腰椎间盘退变，其机制可能是通过调节凋亡因子Fas、FasL的表达，抑制细胞凋亡，从而延缓椎间盘退变。

参考文献：

[1] STEINDLER A. An analysis and differentiation of low-back pain in relation to the disc factor[J]. Journal of Bone and Joint Surgery，1947，29（2）：455-460.

[2] WANG J， TANG T， YANG H， et al. The expression of Fas ligand on normal and stabbed-disc cells in a rabbit model of intervertebral disc degeneration：a possible pathogenesis[J]. Journal of Neurosurgery Spine，2007，6（5）：425-430.

[3] 陈红路，邱晓虎，严晓春.电针加委中刺血治疗急性腰椎间盘突出症疗效观察[J].中国针灸，2009，29（2）：123-125.

[4] ROUSSEAU M A， BASS E C， LOTZ J C. Ventral approach to the lumbar spine of the Sprague-Dawley rat[J]. Lab Animal，2004，33（6）：43-45.

[5] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003.

[6] 邓德万，林建平，陈少清，等.电针委中穴对腰椎退变模型大鼠纤维环细胞caspase3、XIAP蛋白表达的影响[J].中国康复医学杂志，2016， 31（4）：394-398.

[7] 李小川，李雷，王欢，等.Fas/FasL基因在退变腰椎间盘组织中的表达及诱导凋亡作用[J].中华医学杂志，2005，85（24）：1718-1720.

[8] PARK J B， CHANG H， KIM K W. Expression of Fas ligand and apoptosis of disc cells in herniated lumbar disc tissue[J]. Spine，2001， 26（6）：618-621.

[9] WANG H， LIU H， ZHENG Z M， et al. Role of death receptor， mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways in different stages of degenerative human lumbar disc[J]. Apoptosis，2011， 16（10）：990-1003.

[10] SCOTT F L， STEC B， POP C， et al. The Fas/FADD death domain complex structure unravels signaling by receptor clustering[J]. Nature，2009，457（7232）：1019-1022.

（收稿日期：2016-06-23）

（修回日期：2016-07-19；编辑：华强）endprint