头花蓼对幽门螺杆菌感染性胃炎大鼠Gas及SS表达的影响*

简 单， 温丽娜， 孙朝琴， 莫 非*, 李永念*

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004； 2.贵阳中医学院第二附属医院， 贵州 贵阳 550002)



头花蓼对幽门螺杆菌感染性胃炎大鼠Gas及SS表达的影响*

简 单1**， 温丽娜2， 孙朝琴1， 莫 非1***, 李永念1***

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004； 2.贵阳中医学院第二附属医院， 贵州 贵阳 550002)

目的： 检测头花蓼对幽门螺杆菌(H.pylori)感染SD大鼠胃粘膜胃泌素(Gas)和生长抑素(SS)表达的影响，探讨头花蓼抗H.pylori感染性胃炎的作用机制。方法： 42只SD大鼠随机分为造模组26只和空白组16只，采用H.pylori标准菌灌胃SD大鼠建立H.pylori慢性胃炎大鼠模型;造模成功后，造模大鼠分为模型组和头花蓼组，头花蓼组以1.72 g浸膏/(kg·d)的剂量灌胃给药，模型组和空白组大鼠灌胃等量生理盐水，治疗2周后处死大鼠，取胃窦黏膜组织，HE染色观察大鼠胃黏膜组织学改变；免疫组织化学染色观察胃黏膜Gas阳性细胞和SS阳性细胞的改变，原位杂交检测大鼠胃黏膜Gas和SS mRNA的表达水平。结果： 与模型组比较，头花蓼可明显改善H.pylori感染大鼠胃黏膜炎症，病理评分显著降低(P<0.05)；头花蓼组大鼠胃黏膜Gas阳性细胞数量明显减少，Gas mRNA表达水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；SS阳性细胞数量、SS mRNA表达水平较模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论： 头花蓼可修复H.pylori感染慢性胃炎胃黏膜损伤，其机制可能与改善胃肠激素对胃功能调节有关。

螺杆菌，幽门； 胃炎； 头花蓼； 胃泌素； 生长抑素

幽门螺杆菌(helicobacterpylori，H.pylori)感染是引起慢性胃炎的常见病因，胃肠肽类激素如胃泌素(gastrin，Gas)、生长抑素(somatostatin，SS)等，其含量的变化与慢性胃炎的病理过程与严重程度密切相关[1]。前期研究发现H.pylori感染慢性胃炎患者存在Gas与SS调节失衡的现象[2]，本研究复制H.pylori感染慢性胃炎大鼠模型，HE染色观察头花蓼对H.pylori慢性胃炎的炎症改善效果，免疫组化和原位杂交技术观察头花蓼(polygonumcapitatum)对H.pylori感染慢性胃炎小鼠胃黏膜Gas、SS的定位、分泌情况及其mRNA的表达水平，期望从胃肠肽类激素分泌角度探讨头花蓼治疗慢性胃炎的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

H.pylori悉尼株SS2000，由中国疾病控制中心传染病所张建中研究员惠赠，保存于贵州医科大学医学检验学院临床检验教研室。头花蓼浸膏粉，棕色粉末，批号为14196，由浙江众益药业有限公司提供。SPF级SD大鼠，6～8周龄，150～180 g，购买于第三军医大学实验动物中心，SCXK(军)2012-0011。哥伦比亚血琼脂粉、脑心浸液琼脂干粉购自Oxoid，万古霉素、两性霉素、多黏菌素B、TMP购自Sigma，无菌脱纤维羊血购自南京便诊生物科技有限公司，兔抗Gas抗体、兔抗SS抗体购自Bioword，二抗PV-HpR、DAB显色剂购自北京中杉金桥，GAS、SS原位杂交试剂盒均购自武汉博士德。

1.2 方法

1.2.1H.pylori感染性胃炎大鼠模型 参照文献[3-4]取42只SD大鼠适应性饲养1周后，取26只制作H.pylori感染慢性胃炎模型，另取16只作为空白对照组，所有SD大鼠禁食不禁水12 h，5 g/L NaHCO3和消炎痛混合液(使胃黏膜损害加重，更利于H.pylori定植)按体重给予雄鼠1.0 mL/只，雌鼠0.5 mL/只预处理1次；继续禁食不禁水，6 h后给予1×1012cfu/LH.pylori悉尼株SS2000菌液1.5 mL，继续禁食禁水4 h后正常喂食，隔天灌胃，共5次。空白组以等量的无菌脑心浸液肉汤代替，末次灌胃8 周后，禁食禁水24 h。造模大鼠和空白组各取6只SD大鼠处死，按照洛桑会议标准[5]，鉴定模型是否建立成功，大鼠胃黏膜有H.pylori定植且胃黏膜出现慢性炎症病理学改变判断为造模成功。H.pylori造模大鼠分为模型组和头花蓼组，每组10只。

1.2.2 给药方法及标本处理 成功建模后，按照参考文献[6-7] ，取头花蓼临床剂量[3.49 g/(kg·d)]的3倍，对头花蓼组大鼠进行灌胃，连续14 d(1次/d)，空白组和模型组大鼠给予等量的无菌生理盐水。治疗结束后第4周处死所有大鼠，留取大鼠胃窦黏膜组织，行40 g/L中性甲醛固定、酒精脱水、二甲苯透明组织，浸蜡、包埋，制成5 μm的石蜡切片，HE染色或免疫组织化学染色，光镜下观察，并进行病理学评分[7]。另取胃窦黏膜进行4%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH7.0～7.6)固定，固定4 h后，进行常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度为8 μm，用于原位杂交检测。

1.2.3 Gas阳性细胞与SS阳性细胞 取出SD大鼠胃黏膜组织，40 g/L中性甲醛固定，SD大鼠胃黏膜组织制成石蜡切片，通过脱蜡，抗原修复，3% H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶，山羊血清37 ℃孵育封闭20 min，分别滴加兔抗鼠GAS抗体(1∶100)和SS抗体(1∶100)50 μL，湿盒，4 ℃过夜，次日取出至室温，PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体1 d，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤，DAB显色5～10 min，显微镜下控制曝光程度，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染10 s，脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片观察5个视野，计数阳性细胞数，取其平均值。采用图像分析软件Image-Pro Plus计算阳性颗粒灰度值。

1.2.4 Gas mRNA、SS mRNA表达 采用武汉博士德原位杂交试剂盒(内含针对大鼠GAS、SS的特异性寡核苷酸探针，经地高辛标记)。针对Gas、SS靶基因的mRNA探针序列(Gas：Forward primer 5′-3′ACCTTCTCGGAAGCTTCTTGGAAACCTCGCTCCC

A, Reverse primer 5′-3′GAAGCATACGGATGGATGGACTTTGGTCGCCGTA；SS：Forward primer 5′-3′TACTTCTTGGCAGAGCTGCTGTCTGAACCC,Reverse primer 5′-3′AAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATC

C)，按照原位杂交试剂盒进行操作。显微镜下观察，采用图像分析软件Image-Pro Plus计算阳性颗粒灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠胃黏膜组织学观察

空白组大鼠胃黏膜完整、腺体规则，黏膜下层偶见淋巴细胞浸润，无炎症改变；模型组大鼠胃黏膜表面糜烂、破损，腺体肿胀，黏膜下层见大量淋巴细胞浸润，部分形成淋巴聚集灶，呈现慢性胃炎病理改变；头花蓼组大鼠胃黏膜比较完整，腺体规则，黏膜层和固有层散在少量淋巴细胞浸润；如图1。头花蓼组大鼠胃黏膜病理评分介于空白组模型组之间，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠胃黏膜病理评分±s)Tab.1 Histological score of the gastric mucosa in 3 groups

(1)与空白组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

2.2 头花蓼对H.pylori感染大鼠胃黏膜Gas表达阳性细胞及其mRNA的影响

免疫组织化学染色显示各组大鼠胃窦部Gas阳性细胞的免疫反应物呈棕色颗粒，位于胞浆(如图2)；原位杂交证实胃泌素mRNA的阳性信号出现于Gas阳性细胞的核周或核上区，与正常组比较，模型组Gas阳性细胞的数量增多、反映强度增强，Gas mRNA阳性信号加强，差异有统计学意义(P<0.05)；头花蓼组Gas阳性细胞数量较模型组比较减少、Gas mRNA阳性信号较模型组明显减弱，3组阳性灰度比较差异有统计学意义(P<0.05)，如图4。

2.3 头花蓼对H.pylori感染大鼠胃黏膜SS表达阳性细胞及其mRNA的影响

免疫组织化学染色显示各组大鼠胃窦部SS阳性细胞分布于胃窦黏膜的中、下层，偶见于上层，细胞形态不规则，阳性反应呈棕色颗粒，沉淀于胞浆，胞核阴性(如图4)；原位杂交实验证实SS mRNA阳性信号出现于SS阳性细胞的胞核区。与正常组比较，模型组SS阳性细胞数量减少，SS mRNA阳性信号减弱，差异无统计学意义；头花蓼组SS阳性细胞数量较模型组比较增加，SS mRNA阳性信号无明显增加，差异无统计学意义(P>0.05)，如图5。

3 讨论

H.pylori在全球人群中的自然感染率超过50%，全球各地差异甚大，发展中国家高于发达国家。而我国的H.pylori感染率较高，感染率为40%～90%，平均为59%[8]。因此控制H.pylori感染成为治疗H.pylori相关性胃病的重要指标，而目前单纯西药根除H.pylori的效果已不如从前，据报道西药对H.pylori的根除率为70%[9]，对抗生素耐药是H.pylori根除失败的主要原因。因此研发高效的抗H.pylori药物成为全球的研究热点。

Gas和SS是人体重要的胃肠激素，Gas主要由存在于人体胃窦部的G细胞分泌，其可刺激壁细胞和主细胞促进胃酸、胃蛋白酶分泌，增加胃肠黏膜的分裂增殖[10-11]；SS由人体胃窦部的D细胞分泌，其以旁分泌的方式抑制胃酸和胃蛋白酶分泌，亦可抑制Gas释放，并对胃肠道的分泌、吸收、运动功能有普遍的抑制作用，对胃黏膜有直接的保护作用，二者在功能上相互协调，共同维持着胃肠的生

注：A为空白组，B为模型组，C为头花蓼组图1 大鼠胃黏膜组织HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat gastric mucosa

注：A为空白组，B为模型组,C为头花蓼组图2 大鼠胃黏膜Gas表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.2 Gas expression in gastric mucosa

注: A为空白组,B为模型组,C为头花蓼组

(1)与空白组比较，P<0.05； (2)与模型组比较，P<0.05图3 3组大鼠胃黏膜Gas阳性细胞及GAS mRNA表达(原位杂交，×100)Fig.3 Expression of Gas and Gas mRNA on rat gastric mucosa

注：A为空白组，B为模型组,C为头花蓼组图4 大鼠胃黏膜SS表达(免疫组织化学染色，×200)Fig.4 SS expressing in rats gastric mucosa

注: A为空白组,B为模型组,C为头花蓼组

(1)与空白组比较，P<0.05； (2)与模型组比较，P<0.05图5 各组大鼠胃黏膜SS阳性细胞及SS mRNA表达(原位杂交,×100)Fig.5 Expression of SS and SS mRNA on rat gastric mucosa

理功能[12]。有研究显示正常人与慢性胃炎病人胃肠激素的水平不同，变化的胃肠激素有可能会进一步加重疾病的发展[13]，胃肠激素水平的检测可判断治疗效果，具有一定的临床意义。

本实验采用免疫组织化学染色及原位杂交技术检测H.pylori感染性胃炎胃黏膜Gas、SS激素及mRNA的表达水平，结果显示，H.pylori感染后模型组大鼠Gas激素及mRNA表达水平明显上调，而SS激素及mRNA表达水平仅有轻微的增高，推测感染H.pylori后会刺激胃窦部Gas分泌，使胃酸分泌增加，激活胃蛋白酶，破坏黏膜屏障，导致炎症、溃疡形成[14]。经过头花蓼治疗以后，Gas激素及mRNA表达水平明显下调，而SS激素及mRNA表达水平无明显变化，这提示头花蓼对SS的分泌的影响并不明显，其改善胃黏膜的作用主要是通过抑制Gas的分泌实现的。Yana Zavros等[15]也研究表明抑制Gas分泌可有效的抑制H.pylori感染性胃炎。因此，推测头花蓼除了直接抑制H.pylori增殖外，还具有调节胃肠激素的分泌的功能，维持胃肠道的正常生理功能，有助于炎症的恢复。

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(2016-09-26收稿，2016-11-17修回)

中文编辑： 刘 平； 英文编辑： 刘 华

Effects ofPolygonumCapitatumon Gastrin and Somatostatin inHelicobacterpylori-infected Gastritis

JIAN Dan1, WEN Lina2, SUN Chaoqin1, MO Fei1, LI Yongnian1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China, 2.TheSecondAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalcollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect ofPolygonumcapitatumon gastric mucosal gastrin (Gas) and somatostatin(SS) expression of SD rats infected byH.pyloriand to explore the mechanism ofPolygonumcapitatumagainstH.pyloriinfection gastritis. Methods: 42 rats were divided into model group of 26 rats and blank control group of 16 rats. Establishment ofH.pylorirat model of chronic gastritis was established in rats by intragastric administration ofH.pyloristandard strain. After successful modeling, rats were divided into model group andPolygonumcapitatumgroup.Polygonumcapitatumgroup was given 1.72g extractum/kg dose ofPolygonumcapitatumby intragastric administration while model group and blank group were given equal volume of saline by intragastric administration. After 2 weeks of treatment, the rats were killed, the gastric mucosa was taken and the histological changes of gastric mucosa were observed by HE staining. Immunohistochemical staining was used to observe the changes of Gas positive cells and SS positive cells in gastric mucosa. The expression levels of mRNA Gas and mRNA SS in gastric mucosa were detected by in situ hybridization. Results: Compared with the model group,Polygonumcapitatumcan significantly alleviate the inflammation of the gastric mucosa of rats infected with H.pylori, and the pathological score decreased significantly (P<0.05). The number of Gas positive cells of gastric mucosa inPolygonumcapitatumgroup significantly decreased and the expression level of Gas mRNA decreased significantly. The difference was statistically significant (P<0.05). There was no statistically significant difference in the number of SS positive cells and mRNA SS expression level between the model group andPolygonumcapitatumgroup (P>0.05). Conclusion:Polygonumcapitatumcan repair gastric mucosal damage in chronic gastritis infected withH.pylori, and its mechanism may be related to improving the stomach intestine hormone regulation.

Helicobacterpylori; gastritis;Polygonumcapitatum; gastrin; somatostatin

贵州省科学技术基金[黔科合(2014)2027号]；贵州省科技合作计划基金[黔科合LH(2015)7417号]；贵州省卫生计生委科学技术基金(gzwikj2015-1-003)；贵阳市科技局计划项目[筑科合同(2014001)]

时间：2016-12-15

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161215.1534.004.html

R285.5； R573.3

A

1000-2707(2016)12-1402-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.12.008

**贵州医科大学2015级研究生

***通信作者 E-mail:418611579@qq.com； 15338505721@qq.com