3T3-L1脂肪细胞诱导分化的研究进展

刘 秀，刘新农，李天佳，刘 暴

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院血管外科，北京100730

·综述·

3T3-L1脂肪细胞诱导分化的研究进展

刘 秀，刘新农，李天佳，刘 暴

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院血管外科，北京100730

随着脂肪代谢性疾病的增多，有关脂肪细胞的体外研究成为近年来研究热点。3T3-L1前脂肪细胞系是建立成熟脂肪细胞模型最为常用的细胞系之一，但经典的脂肪细胞诱导方案存在转化率低、转化不均匀等问题。近年来，诸多学者通过改变诱导剂作用时间、增加新的诱导药物等方法，即改良诱导法，进行脂肪细胞模型的建立。本文主要从传统诱导法和改良诱导法两方面，总结了3T3-L1脂肪细胞诱导分化的研究进展。

3T3-L1前脂肪细胞系；脂肪细胞模型；转化率；传统法；改良法

随着人们生活水平的不断提高，肥胖及其相关疾病的发病率逐年上升，由此而导致的家庭及社会负担亦不断加重。脂肪细胞代谢及功能异常是导致肥胖的核心机制之一[1- 2]。目前，有关脂肪细胞代谢及功能的研究已成为热点。在体外实验中，脂肪细胞是研究脂肪相关问题的基本工具。近年来，诸多改良诱导法的报道不断增多，现就目前诱导方法及各自优缺点做一综述。

传统诱导法

传统诱导方法，即经典“鸡尾酒”诱导法，在3T3-L1前脂肪细胞融合培养48 h基础上(基础培养基Ⅰ)，将一定浓度的地塞米松、3-异丁基- 1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl- 1-methylxanthine，IBMX)、胰岛素序贯加入3T3-L1前脂肪细胞培养液中(诱导剂Ⅰ)48 h后，更换为只含一定浓度胰岛素的培养基继续培养48 h(诱导剂Ⅱ)，之后用普通高糖DMEM培养基培养(基础培养基Ⅱ)，每2 d换液，历时约12～14 d，可将其成功诱导为成熟脂肪细胞[3]。试剂配制如下：(1)基础培养基Ⅰ：高糖DMEM培养液、10%(体积分数)小牛血清、1%青霉素和链霉素；(2)诱导剂Ⅰ：高糖DMEM培养液、10%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1%青霉素和链霉素、胰岛素(1 μg/ml)、地塞米松(0.25 μmol/L)、IBMX(0.5 mmol/L)；(3)诱导剂Ⅱ：高糖DMEM培养液、10%(体积分数)FBS、1%青霉素和链霉素、胰岛素(1 μg/ml)；(4)基础培养基Ⅱ：高糖DMEM培养液、10%(体积分数)FBS、1%青霉素和链霉素。

细胞系选择1975年，Green等[4]报道小鼠的3T3细胞系是具有多项分化潜能的前体细胞系，属于成纤维细胞系。并对其不同亚群进行研究比较，包括3T3-L1、3T3-M2。研究证实，在体外脂肪细胞模型的建立中，3T3-L1细胞系是转化率最高、最具特性和最为稳定的亚细胞系之一[4- 5]。3T3-L1在适当诱导条件下所诱导的脂肪细胞，无论是细胞形态还是生物性能都与体内脂肪细胞相似，为体外脂肪细胞的实验研究提供了可能。

接触抑制加入诱导剂前的细胞间接触抑制是脂肪细胞诱导过程中的关键。3T3-L1细胞本身并无脂肪细胞的特性，细胞在快速增殖期生长为成纤维细胞。但经过接触抑制后细胞间的自噬作用导致线粒体重构[6]，同时激活胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor- 1，IGF- 1) 受体信号通路[7]，使其开始向脂肪细胞转化，并不断融合为脂滴。诱导剂的加入能够加速其向脂肪细胞转化的过程，但在没有发生接触抑制的细胞中即使加入诱导剂也不能使其转化为脂肪细胞[8]。目前细胞接触抑制时间并不统一，经典的诱导方法接触抑制时间为48 h，也有研究报道采用24 h[9]，因之后的诱导中另外加入了其研究的提取物质，无法证明缩短接触抑制时间对细胞转化的影响。

诱导剂及其浓度在不添加任何诱导剂的情况下，细胞发生接触抑制后约要2～4周才能转化为脂肪细胞[8]。为加速其转化过程，研究者尝试加入不同的诱导剂：IBMX、皮质激素、胰岛素、维生素、吲哚美辛等。研究对比得出经典的诱导剂：IBMX、地塞米松、胰岛素。其分子机制分别为：IBMX，一种cAMP磷酸二酯酶抑制剂，能够激活cAMP依赖性蛋白激酶途径，促进过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白家族(CCAAT/enhancer-binding protein family，C/EBPs)的表达，激发3T3-L1向脂肪细胞转化[10]；地塞米松，一种抗炎类固醇分子，通常用于激活糖皮质激素受体途径，进而促进C/EBPs的表达[11]；胰岛素，通过IGF- 1激活有丝分裂原蛋白激酶途径诱导前脂肪细胞的增殖分化[2]。

PPARγ为脂肪特异性核受体，调控脂肪细胞相关功能蛋白的表达。是体外脂肪细胞诱导过程的关键因素[12]。C/EBPs则为脂肪细胞诱导分化过程中的另一关键因素，能够加速终末期脂肪细胞的分化，并通过与PPARγ的共同作用进一步促进脂肪细胞的生成。此外，C/EBPα为C/EBPs成员之一，其含有碱性亮氨酸拉链结构，能够与多个脂肪细胞基因的启动子结合，加速成纤维细胞向脂肪细胞的转化[13- 14]。加入诱导剂的目的是为了增加上述调控因子的表达，进而缩短脂肪细胞的转化过程。

不同的研究所使用的诱导剂浓度不尽相同，Scott等[2]对PubMed数据库45篇文献中的3种诱导剂浓度进行了统计汇总，其中，IBMX作用浓度相对固定，为500 μmol/L；但亦有个别报道用低浓度，如0、100、250 μmol/L[15- 17]。对于地塞米松而言，不同研究中浓度不同，大多使用1000 nmol/L。胰岛素浓度波动则较大，介于0.01～5 μg/ml间。通过观察不同浓度的胰岛素对脂肪细胞转化和脂滴融合的影响，发现1 μg/ml浓度时脂滴形态最好[4]。因此，在经典诱导方法中多采用以下浓方案：IBMX(0.5 mmol/L)、地塞米松(0.25 μmol/L)、胰岛素(1 μg/ml)。

血清的选择FBS是3T3-L1细胞诱导转化过程中不可或缺的[18]，其包含的生长激素(growth hormone，GH)(10% FBS含有 4～10 ng/ml GH)能够激活PARPγ的表达，进而加速脂肪形成，促进脂滴融合，且只有细胞进入转化状态后FBS才能发挥其促转化作用[19]。有研究在诱导过程中将其替换为小牛血清或成年牛血清，脂肪细胞的转化率明显降低[20]。所以，在细胞培养时选择小牛血清后换为FBS进行诱导，可在发挥FBS的作用同时节省成本。

2004年，有研究提出了信号转导和转录因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)理论，即FBS中所含有的GH为STATs的激活剂，通过激活STATs的表达，进而促进3T3-L1的转化，并提出STATs的激活剂GH或泌乳素来替代FBS的理论。以降低脂肪模型建立的成本，但目前缺乏大量的试验对此方法进行肯定[21]。

改良诱导方法

随着体外脂肪细胞研究的深入，发现传统诱导方法存在转化率低且不均匀的问题[1]。Mehra等[22]研究认为，细胞培养板厂商型号对细胞的转化率有明显影响，通过选择合适的培养板后转化率基本可达到80%。Lee等[23]发现3T3-L1脂肪细胞转化不一致，为避免转化细胞数不均匀对实验的影响，他们对转化得到的脂肪细胞进行分离，之后再进行相关实验研究。培养板的影响机制并未阐述且不能排除偶然性的存在，而分离转化的脂肪细胞则进一步加重了实验的工作量，且两者均未在诱导方法上做任何改良。

改良鸡尾酒诱导法是在经典鸡尾酒诱导法的基础上，针对其转化率低和不均匀等问题，从增加诱导剂Ⅰ和/或Ⅱ的作用时间以及新的诱导药物等方面进行改良，从而提高脂肪细胞的转化率，为体外脂肪细胞模型建立提供更为稳定的培养方法，进一步辅助完成脂肪细胞代谢及功能相关疾病的研究。

增加诱导剂作用时间

诱导剂Ⅰ：Zhu等[24]在研究锌-a2-糖蛋白抑制3T3-L1诱导转化的脂肪细胞的分化和增殖时，诱导剂Ⅰ的作用时间为72 h，相比传统鸡尾酒法增加24 h，其转化率达到90%以上。

诱导剂Ⅱ：Lee等[25]则保持诱导剂Ⅰ作用时间不变，而将诱导剂Ⅱ的作用时间增加至72 h；还有一些研究者将诱导剂Ⅱ的作用时间延长至120 h[26]，据报道其转化率为80%以上。

诱导剂Ⅰ和Ⅱ：Lu等[27]在研究短暂性低氧对脂肪细胞分化过程中胰岛素敏感性和三酰甘油融合情况的影响时，同时将诱导剂Ⅰ和Ⅱ的作用时间均延长至96 h，其转化率同样在80%以上。

还有许多研究根据传统诱导药物作用机制，针对脂肪诱导的方法进行了改良，以解决体外脂肪细胞模型建立时转化率低的问题。Hua等[28]将诱导剂Ⅰ中的一种试剂IBMX的作用时间增加至96 h，即在诱导剂Ⅱ中加入IBMX，其转化率为90%。

我们前期研究对传统诱导方法中诱导剂Ⅰ的作用时间进行了对比，比较了诱导时间分别为48、72、96 h时研究所得到的脂肪细胞在转化率和生物活性上的差异，结果显示，72 h时细胞的转化率和脂肪成熟情况均较好。因此，我们建议在体外脂肪细胞的诱导中将诱导剂Ⅰ的作用时间调整为72 h[29]。但在延长诱导剂作用时间的基础上能否缩短后期脂滴融合时间，进而实现既提高转化率又节省诱导总时间，仍待进一步研究。

新增药物曲格列酮为PPARγ激动剂之一。Vishwanath等[30]在传统诱导剂Ⅰ中加入40 μmol/L曲格列酮，其他细胞培养和诱导方法与传统诱导法相同，结果发现，加入曲格列酮后3T3-L1细胞在第10～12天时基本上全部转化为脂肪细胞，转化率明显高于对照组，且脂滴融合持续时间至少为10 d。

甲状腺素在脂肪细胞诱导过程中同样能够增加PPARγ1、2的表达。Mishra等[31]在对3T3-L1脂肪细胞进行培养诱导时，诱导剂为1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、2 nmol/L甲状腺素T3(对照组不加)，诱导时间延长至60 h，所用细胞培养基同传统诱导方法。在诱导后第7天通过油红O染色观察，结果显示甲状腺素组转化率高出对照组2～5倍。同时，该研究也增加了诱导剂IBMX和地塞米松的作用时间，再一次证实了作用时间对脂肪细胞转化率的影响。

上述两种新的诱导药物均通过激活PARPγ表达来提高脂肪细胞的转化率。还有一些研究在3T3-L1脂肪细胞诱导时加入某种药物，如苯基乳酸(一种从植物乳酸杆菌中提取的物质)、非诺贝特(过氧化物酶增殖体受体激活物受体a)、西地那非(5型磷酸二酯酶抑制剂)、雷洛昔芬(选择性雌激素受体调节剂)，上述药物均能够提高脂肪细胞转化率[32- 35]。但其研究目的是为了证明药物对脂肪代谢的影响，并非辅助脂肪细胞模型的建立，此类药物能否用于3T3-L1脂肪细胞的诱导尚需研究证明。目前尚无公认的新药物。

此外有学者研究发现，3T3-L1细胞的克隆代数对细胞转化率也有影响，1～20代的细胞随机种板，分别进行3T3-L1细胞向脂肪细胞转化的诱导培养，结果除了第2代细胞没有转化外，其他代数细胞均可以转化，其中第5代3T3-L1细胞的转化率最高[2]。因此，在进行脂肪细胞诱导时最好将细胞代数控制在7代以内，同时细胞传代时应控制其细胞数目为70%～80%时进行，一旦细胞进入接触抑制期后其分化潜能将明显下降。

展 望

面对人类脂肪代谢性疾病发病率高的这一现实问题，成熟脂肪细胞体外模型的建立就越发重要。针对传统诱导方法所遇到的问题进行方法的改良，将会为之后的相关脂肪代谢问题研究提供更好的体外模型。目前，如何选择一个比较一致的诱导方案，以便为不同的研究提供标准化的操作步骤，进而增加不同研究结果间的可比性，将是未来研究的重点。具体地，在诱导剂浓度、诱导时间、新增诱导药物等方面均需进一步研究验证。

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ResearchProgressoftheDifferentiationof3T3-L1PreadipocytesintoMatureAdipocytes

LIU Xiu，LIU Xinong，LI Tianjia，LIU Bao

Department of Vascular Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

LIU Bao Tel：010- 69152502，E-mail：liubao72@aliyun.com

Along with the increase in the prevalence of lipid metabolism disorders，invitroresearch on the adipocytes has been a hot topic in recent years. 3T3-L1 preadipocyte line is one of the most commonly used cell line for establishing adipocytes models. However，for 3T3-L1 cell lines，the traditional method，known also as the “Cocktail” method，have disadvantages including low transformation rate and heterogeneous conversion. Therefore，many studies aimed to improving the induction method by changing the time of inducers or adding other new drugs have been performed(known as the improved method). The present study was to summarize the progress of the traditional methods and the improved methods for inducing 3T3-L1 cell lines to mature adipocytes.

3T3-L1 cell lines；adipocyte models；differentiation rate；traditional method；improved method

刘 暴 电话：010- 69152502，电子邮件：liubao72@aliyun.com

R34

A

1000- 503X(2017)05- 0727- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.021

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：727-731

2016- 08- 12)