肺炎支原体的实验室检测技术研究进展

李青曌，史文元，陈虹亮,2

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2017.09.016

肺炎支原体的实验室检测技术研究进展

李青曌1，史文元1，陈虹亮1,2

肺炎支原体是引起呼吸道感染的重要病原体之一。近年来，我国肺炎支原体发病率呈不断上升趋势，占小儿肺部疾病发病率的30%。肺炎支原体感染后早期临床症状不典型，并且对作用于细胞壁的抗生素不敏感，所以早期实验室检测对肺炎支原体的治疗具有重要意义。因此，本文就关于肺炎支原体检测的实验研究进展及展望进行简要综述。

肺炎支原体；检测技术；进展

肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia,Mp)是一种介于细菌与病毒之间、在有氧或无氧环境中均能独立存活的最小病原微生物，主要通过呼吸道飞沫或气溶胶传播，是引起社区获得性肺炎的重要病原体之一[1-2]。Mp感染早期临床症状与其他细菌和病毒感染肺炎无明显区别，多见剧烈咳嗽、发热(常为稽留热)、畏寒、头痛和咽痛[3-5]，且对作用一般细菌细胞壁的抗生素，如青霉素、头孢菌素等不敏感，必须需选用抑制蛋白质合成的大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类抗生素进行治疗[6-8]。因此，Mp的早期实验室检测对合理选用抗生素治疗具有重要意义。目前Mp实验室检测方法主要有分离培养、抗原检测、抗体检测和基因诊断技术检测等。

1 分离培养

Mp分离培养作为传统的检测手段，是判断Mp感染的“金标准”。Mp分离培养常以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成液体或固体培养基，初次分离需要孵育7～15 d，待培养基指示剂由粉红色变黄色后，及时转种于固体平板培养基，5% CO2环境中培养1～2周可长出菌落直径小于0.5 mm 的荷包蛋样菌落，以此可初步诊断，再进一步进行生化反应和血清学鉴定[9]。Kashyap等[10]认为采用咽拭子或痰液标本进行Mp分离培养是目前检测Mp感染的可靠方法之一，但是Mp分离培养对培养环境要求较苛刻，耗时长，一般培养分离阳性率不高，难以作为临床常规项目开展。近年来，Puppe等研发出快速检测Mp的培养基，它是利用Mp生长代谢产物让培养基液体中指示剂从红色变成澄黄色来判断Mp生长，快速培养法直接检测Mp病原体，且培养基中富含高营养和快速生长因子，标本中含有微量的病原体就可迅速增殖，大大缩短了培养时间。还有研究报道，该方法检测Mp的假阳性率较高，但容易被细菌和真菌污染而造成假阳性，故该方法特异性还有待进一步提高，因此有必要在培养48 h作第一次判定结果后转种进一步做一般细菌培养。

2 抗原检测

Mp抗原检测方法包括对流免疫电泳(counter immunoelectro - phoresis)、免疫印迹(immunoblot-ting)和抗原捕获EIA(antigen capture enzym eimmunoas-say) ，这些方法操作耗时费力，敏感性较低，并且检测过程中需Mp特异性抗体，不适于临床检测。Miyashita N等[11]以不同菌株Mp单克隆抗体作为包被物，采用双抗体夹心ELISA检测Mp抗原，同时以PCR法作平行测定，结果显示两种方法无显著性差异。该方法具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等诸多优点，并且和其它支原体没有交叉反应，但同时亦需要特异性好、效价高的Mp单克隆抗体，所以未能广泛普及，目前市场还尚无商品化的Mp抗原检测试剂盒。

3 血清学检测

Mp感染机体后，经过免疫反应体内可产生特异性的IgM、IgG类抗体，其中IgM抗体在感染1周后可检测出阳性，3～4周后达高峰，能作为早期感染的诊断指标。IgG抗体出现较迟，其浓度峰在Mp感染后的第5周，一般提示有既往感染，单独检测意义不大[4,12]。Mp血清学检测主要包括非特异性抗体试验和特异性抗体试验。

3.1 非特异性抗体试验Mp感染机体后，血清中除出现特异性抗体外，还存在刺激机体产生的非特异性冷凝集素。该凝集素能与O型Rh阴性红细胞在4 ℃条件发生凝集反应，血清滴度≥1∶64，判为阳性，效价越高或者双份血清效价呈4倍以上，提示近期Mp感染的可能性较大。非特异凝集试验操作简单，但其特异性相对较低，除Mp感染患者外，如流感病毒、立克次体和腺病毒等感染也会产生冷凝集素，造成假阳性，因此该方法只可作为辅助诊断Mp感染的方法。

3.2 特异性抗体试验Mp特异性抗体试验包括补体结合试验(Complement fixation test，CFT)、颗粒凝集试验(particle agglutination test, PAT/PA)、间接血凝试验(indirect hemagglutination test, IHT)、间接免疫荧光试验(Immuno-fluorescence test, IFT)和酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assays, ELISA)。

3.2.1 CFT试验 CFT试验是最早应用于Mp实验室常规诊断的试验方法。Mp的抗原糖脂成分可刺激机体产生特异性抗体，与Mp抗体结合后形成固有补体使之不发生溶血反应[13]。该方法以Mp糖脂类抗原为标记物，检测血清中是否存在Mp抗体，其中抗体效价呈倍增长，或单份血清效价≥1∶64～1∶128 者有诊断价值，通常用双份血清试验可判定Mp感染是否处于急性期或恢复期。刘方鹤等报道CFT试验反应稳定，敏感性和特异性均好，但较为烦琐，且以检测IgM抗体为主，不能检测IgG等抗体，初次感染时出现阳性率高，再感染者容易出现假阴性，并且在老年体弱患者中，因此，即使CFT试验呈阴性也不可以排除Mp感染，故临床应用较少。

3.2.2 PA试验 PA试验是采用致敏粒子与试验血清进行孵育发生凝集的血清学试验。双份血清(间隔2周)抗体滴度呈4倍或4倍以上上升或降低或抗体滴度持续>1∶160时，均可确诊为Mp感染，这是目前国际公认的标准。我国学者靳冰等研究结果显示PA试验灵敏度为96.4%，特异性为100%，以及准确度为97.9%，说明PA试验特异性强，操作简便，适用于临床快速诊断，但该方法采用的Mp进口试剂价格昂贵，窗口期不能被检测，易造成漏检。

3.2.3 IHT试验 IHT试验主要用于检测IgM抗体，在微量凝血板上被检血清与血清对照，其余各孔加致敏红细胞后震荡混匀，红细胞凝集程度在“”、血凝抗体滴度≥1∶32以上即有诊断意义[14]。李正秋等报道，IHT实验的灵敏度为97.5%，显著高于ELISA检测法86.5%，其特异性70.9%不及ELISA检测法91.5%，二者联合检测可提高检测阳性率。该试验操作方法相对简单、快捷，但因其特异性不高，且与生殖道支原体存在交叉反应而未推广。

3.2.4 IFT试验 IFT试验是标记免疫技术中发展最早的一种。该法以培养基中生长的Mp菌落制作抗原印片，与被检血清(Mp-IgM、IgG抗体)孵育形成抗原抗体复合物，再用抗抗体的荧光标记抗体着色，荧光显微镜下观察，效价>1∶16为阳性[11, 15]。有学者报道IFT试验检测Mp感染阳性率为64%，灵敏度为98.3%，特异性为87.5%，明显优于快速培养基法(阳性率26%，灵敏度为33.3%，特异性为85%)，两方法比较而言，该方法特异性较高，但需购置荧光显微镜才能观察，只适用于一般实验室。

3.2.5 ELISA试验 ELISA试验利用酶标记抗体作为标志物，并将提纯的Mp膜蛋白P1、P116或P30抗原[16-17]吸附在固相载体表面，再用洗涤液将游离成分洗除，最后加入TMB底物后显色来判断结果。ELISA法是国内应用较为成熟的实验方法，目前临床上多应用商品化试剂盒来进行快速简便检测，Narita Mitsu等研究认为ELISA法具有较好的准确度和特异性，可分别高达96%、98%，优于CFT法，是诊断Mp感染实用可靠的手段，并且敏感、快速，适合于各级临床实验室，可作为Mp感染的常规检测方法。

4 分子生物学检测

自1980年以来，通过实验室和临床研究，证实了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术检测Mp感染的可靠性，目前PCR技术也是国内外发展较快的检测支原体的方法之一。PCR可分为普通PCR、实时荧光定量PCR， 而普通PCR容易被污染而出现假阳性；实时荧光定量PCR具有快速，特异性强，灵敏度高等特点且无交叉反应现象，对Mp感染的诊断价值优于普通PCR法。运用实时荧光定量PCR技术检测患者痰液、咽拭子、支气管灌洗液中的Mp-DNA，通过高温加热使模板的两条DNA链解链后，引物分别与模板DNA和荧光探针一起退火，通过基因扩增技术，可以在短时间内使含量极低的核酸片段扩展至数百万个拷贝，可检出≥10 cfu/mL的Mp[18]。佟青研究发现，PCR诊断Mp感染的阳性率为73%，明显高于培养法25%，但血清学阳性率为98.5%，PCR灵敏度不及血清学，但特异性能达到97%，在Mp感染早期诊断优于培养法和血清学试验。PCR技术大大提高了检测特异性，并且可了解Mp在患者体内感染及自我复制的情况，对早期检测Mp感染具有重要意义[19]。但其过于敏感，操作不当或环境因素容易受到污染会导致结果出现假阳性或假阴性，另外该技术要求特殊仪器设备，较高的人员素质，所以在县级医院中难以普及。

5 展 望

综上所述，基于分离培养、抗原检测、抗体检测和基因诊断技术为Mp感染的诊断提供了非常有效的检测手段，但迄今为止还尚无统一的Mp实验室检测方法。由于各种检测技术参差不齐，各种检测手段都有优缺点，建议根据临床要求，选择合适的检测方法，如Mp初筛可选用灵敏度较高的ELISA法、确诊可采用特异性较好的分子生物学诊断方法，同时还可采用多种检测手段结合可提高Mp感染阳性检出率。相信随着Mp基础研究的深入以及检测技术的进一步发展，必将发现新的Mp检测靶点，并开发出更加特异、敏感的检测方法，从而能够准确、快速地诊断Mp感染。

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ProgressinclinicaldetectionofMycoplasmapneumonia

LI Qing-zhao, SHI Wen-yuan, CHEN Hong-liang

(1.FirstPeople’sHospitalofChenzhou,Chenzhou423000,China; 2.InstituteofTranslationalMedicine,UniversityofSouthChina,Chenzhou423000,China)

Mycoplasmapneumoniais one of the important pathogens leading to respiratory tract infection. Recently, the incidence ofM.pneumoniaeinfection increased rapidly, which contributes about 30% of lung disease in children. The early clinical symptoms forM.pneumoniaeinfection is not typical, which is not sensitive to antibiotics acting on cell walls. Therefore, early laboratory detection ofM.pneumoniaeis very important for later treatment. Herein, this paper aims to sum up the recent development progress ofM.pneumoniaedetection.

Mycoplasmapneumonia; detection technology; progress

Chen Hong-liang, Email: chenhongliang2007@126.com

陈虹亮，Email: chenhongliang2007@126.com

1.郴州市第一人民医院检验医学中心，郴州 423000； 2.南华大学转化医学研究所，郴州 423000

R375

：A

：1002-2694(2017)09-0841-04

2017-03-29编辑：刘岱伟

郴州市科技局科技计划项目(czkj2016052, czkj2016045)资助

Supported by the Foundation of Chenzhou Municipal Science and Technology Bureau (Nos. czkj2016052 and czkj2016045)