一氧化氮合酶各种亚型的信号通路对心力衰竭的作用机制与治疗的研究进展

金春花、刘文博、关宏锏综述，金春子审校

一氧化氮合酶各种亚型的信号通路对心力衰竭的作用机制与治疗的研究进展

金春花、刘文博、关宏锏综述，金春子审校

一氧化氮（NO）是心脏的一种重要的信号分子，它是由三种NO合酶（NOS）即神经型NOS（NOS1）、诱导型NOS（NOS2）和内皮型NOS（NOS3）产生的内源性物质。NO信号通过环鸟苷酸（cGMP）依赖途径或非依赖途径进行翻译后修饰（即cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化，巯基-亚硝基化等）从而调控下游蛋白。NOS的功能障碍（即表达、定位、耦合和活性的改变等）存在于各种心脏疾病中（如心力衰竭），导致了收缩功能障碍及心室重构和肥大。本文将重点阐述在健康和疾病状态下NOS各种亚型的信号通路，并讨论现有的和潜在的方法通过靶向NO通路来治疗心力衰竭。

综述；一氧化氮合酶；心力衰竭

一氧化氮（NO）是由NO合酶（NOS）蛋白家族合成的多种功能性调节气体。在哺乳动物中，有三种NOS。1995年Balligand等以及1999年Xu等提出，神经型NOS（NOS1）和内皮型NOS（NOS3），在心室肌细胞中的表达方式为结构型表达，而诱导型NOS（NOS2）的表达受环境因素影响（例如细胞因子的产生受免疫应答影响）。通过NOS1和NOS3生成的NO是钙依赖型，而NOS2生成的NO是钙通道/钙调蛋白非依赖性的。NOS是由两个同源单体组成的二聚体。NOS二聚体的C端（还原酶结构域）包括黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合位点和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），而N端（氧合酶结构域）由L-精氨酸、四氢生物蝶呤（BH4），游离氧（O2），亚铁血红素基团组成。另外钙调蛋白结合位点位于氧合酶结构域和还原酶结构域之间。黄素的作用是将C端（还原酶结构域）的电子转移到另一N端（氧合酶结构域），通过氧化L-精氨酸而生成L-瓜氨酸和NO[1]。

氧化应激状态下，NOS的产物O2-中断了NO的产生并代替了NO，使NOS长期解偶联。BH4是结合与血红素氧化酶域促进L-精氨酸生成NO，但消耗或氧化BH4时可以使电子从还原酶结构域流向氧合酶结构域而使氧生成O2-[2]。此外，NOS3中的谷胱甘肽化在半胱氨酸689和半胱氨酸908阻断剂的作用下NADPH还原为NADP，从而导致在还原酶结构域中生成O2

-。有报道表明，ONOO-的毒性也同样使NOS3解偶联[3]。因此，在心肌细胞中，NOS主要生成NO。然而，在疾病的条件下，NOS也能导致O2-的生成和ONOO-水平的增加[4]。

1 NOS1 信号

1989年Knowlese等在大脑中首次发现NOS1，被命名为nNOS。然而，这种酶在各种细胞类型（包括心室肌细胞）中表达，因此又称为NOS1。NOS1在心肌中主要存在于心肌细胞的肌质网（SR）中，但也存在于线粒体、高尔基体和细胞膜中[1]。1999年，Xu研究团队发现SR中表达NOS1。这种被表达的NOS1能够控制肌质网钙泵（SERCA）而调节细胞内钙离子的重吸收[5]。显然，NOS1源性NO是心肌细胞中钙离子的调控中至关重要的调节因子。通过使用NOS1基因敲除和心肌细胞特异性NOS1表达模型与NOS1抑制剂的结合发现，正常心肌中NOS1产生的NO对正常心脏的收缩和舒张起着调节作用。是由NOS1产生的NO通过环鸟苷酸（cGMP）依赖机制，调节心肌细胞膜中的L型钙通道的活性，以减少细胞内大量的一过性钙离子内流，从而调控细胞内钙超载。相比之下，细胞内的Na+/Ca2+交换则不受影响[6]。在SR中，NOS1源性NO促进心肌舒张，是通过增加蛋白激酶A（PKA）依赖的受磷蛋白的磷酸化位点16丝氨酸（P-Ser16PLN）和Ca2+/钙调蛋白依赖激酶Ⅱ（CaMKⅡ）-依赖的受磷蛋白的磷酸化位点17苏氨酸磷酸化（P-Thr17PLN）来促进肌质网钙泵（SERCA）对钙的重吸收，继而抑制蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的活性[6]。Jin等[7]研究发现在疾病心脏中NOS1通过PKG依赖的心肌肌钙蛋白I的磷酸化位点23/24丝氨酸（cTnI23/24）和心脏肌球蛋白结合蛋白C的磷酸化位点273丝氨酸（cMyBP-C273）的磷酸化抑制肌丝钙敏感性，导致细胞内游离钙离子增多，继而使SR的钙重吸收也增多而调控心肌细胞收缩性。NOS1源性NO可通过巯基-亚硝基化直接激活肌质网钙通道蛋白（RyR）并增加SR的钙离子释放，或间接地通过调节PKA、蛋白磷酸酶（PP）活性介导的受磷蛋白的磷酸化，调控RyR活性以及增强黄嘌呤氧化还原酶（XOR）活性和细胞收缩。 NOS1除了生成NO，也可以得到一个电子生成NO的

2 NOS3信号

NOS3首次发现于冠状动脉内皮细胞，被称为eNOS。然而，这种酶也存在于多种细胞类型中（包括心室肌细胞），被更名为NOS3。在心肌细胞，NOS3结合微囊蛋白-3（Caveolin-3）存在于心肌细胞的胞膜小凹（caveolae）中。除了能够增加[Ca2+]i，NOS3也可以通过蛋白激酶（Akt）激活丝氨酸1179位点的磷酸化，这对终末期心力衰竭的心肌保护起到重要作用[10]。虽然NO是高度可扩散性的气体，但NOS信号具有时间和空间的位点局部性[1]。由于NOS1和NOS3存在于心肌细胞的不同部位（心室肌细胞caveolae中和SR中），它们有各自的信号转导通路、终末靶蛋白以及对心肌功能的影响。与NOS1不同的是，NOS3信号不能调控心肌细胞的收缩，只能调控β肾上腺素受体（β-AR）刺激对其引起的收缩。在心肌细胞caveolae中，NOS3定位于L-型钙通道（LTCC）和β-肾上腺素能受体位点处[1,11]。超氧化物歧化酶（SOD）和NOS3存在的部位相同，可以降低O2-含量。含有O2-的缓冲液，通过SOD驱动NOS3介导cGMP/可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）/PKG信号通路来使多种靶蛋白磷酸化（即LTCC）。与敲除NOS3基因（NOS1-/-）心肌细胞相比， NOS3-/-心肌细胞给予β-AR刺激，其收缩力增加。由于相同的亚细胞定位，NOS3可以调控LTCC。总之，快速抑制野生型心肌细胞NOS3或NOS3-/-，β-AR刺激强度更高，钙离子内流增加[1,11]。Sun 等[12]于 2006提出，女性心肌细胞NOS3对LTCC的作用影响高于男性，这说明NOS3信号有性别差异。除了限制β-AR激发细胞内钙离子内流外，NOS3信号也可以缩短动作电位时程。在给予β-AR刺激时，NOS3-/-小鼠动作电位（AP）延长。决定动作电位时程的是各种K+通道。然而，在野生型和NOS3-/-心肌细胞中的K+通道变化（瞬时外向电流（Ito）、静息电流（IKsus）、内向整流电流（IK1））无明显变化[13]。因此，可以推断，在NOS3-/-心肌细胞中增加钙离子内流可以使Na+/Ca2+交换（NCX）增强，进而延长动作电位时程。此外，在NOS3-/-心肌细胞中，增加钙离子内流可以导致SR的钙负载。如果SR的钙离子超负荷，可以导致钙离子自发性释放和后除极[14]。这些情况也存在于NOS3-/-小鼠心肌细胞中。因此，NOS3抑制LTCC可以抑制早后除极来预防心律失常的发生。折返性心律失常可以使AP持续时间延长。不幸的是，绝大多数心力衰竭患者的死因是心律失常[15]。因此，NOS3功能异常可能参与心力衰竭患者的心律失常。NOS3参与心律失常的发生外，还可以抑制心肌肥大。诱导心肌细胞病理性肥厚的主要途径是活化T细胞核因子（NFAT）钙调神经磷酸酶通路。通过介导LTCC钙离子内流激活钙依赖磷酸酶，使细胞质磷酸化和NFAT转移，进一步导致肥厚性基因的表达。因此，NOS3和NO/ cGMP/PKG抑制LTCC会减弱钙调磷酸酶的活性，从而抑制NFAT易位和心肌肥厚。总之，NOS3源性NO通过限制钙离子内流对心肌有一定的保护作用，可以预防心律失常的发生和抑制心肌细胞肥厚。

3 NOS2的信号

NOS2首先在有活性的巨噬细胞中被发现，被称为诱导型一氧化氮合酶，并为了统一将其更名为NOS2。在炎症反应中，心室肌细胞也能诱导NOS2的表达。普遍认为NOS2参与多种病理条件下的心肌损伤，如缺血再灌注损伤，败血症，衰老，心肌梗死和心力衰竭。NOS2信号通过cGMP依赖途径和非依赖途径对不同的终末靶蛋白进行多种翻译后修饰（如磷酸化，S-亚硝基化， 硝化和氧化）,会导致心肌收缩功能障碍。然而，也有研究发现NOS2表达的积极影响。这种差异可能是由哪种途径被激活（cGMP依赖途径或非依赖途径）和/或终末靶点有关，这可能取决于心脏中的ROS水平。在疾病早期阶段和/或当NOS2被表达时，ROS水平很可能会下降。这将允许cGMP依赖途径介导NOS2信号表达，从而达到保护心肌的目的。例如，NOS2信号可以通过介导PKG磷酸化途径减弱β-AR刺激ICa，继而限制非生理条件下的钙离子内流。然而，由于NOS2的激活是钙通道/钙调蛋白非依赖性的，持续性表达NOS2会降低L-精氨酸的浓度，进而导致NOS2的解偶联和O2-的生成[16]。此外，通过线粒体、NADPH氧化酶和XOR可增加心力衰竭患者血中的O2

-含量。由此产生的高浓度的ONOO-。事实上，高浓度的ONOO-会增加NOS2的表达，从而引起心肌收缩功能障碍。因此，NOS2对心肌收缩功能的影响（有利或不利）是时间依赖性的。然而，研究表明，用NOS2基因敲除（NOS2-/-）小鼠制作心力衰竭模型显示，NOS2的表达对心力衰竭有害。尤其对于压力负荷过大（小鼠主动脉缩窄模型）或心肌梗死时，NOS2-/-小鼠可以更好的保护心肌，使减少心肌肥大、心室重构、心室扩大、心肌纤维化、收缩功能障碍、细胞凋亡以及降低死亡率[17]。在心力衰竭中，NOS2导致心肌收缩功能障碍的机制是通过在β-AR刺激下减少钙离子瞬变幅度来抑制基础收缩力、减弱正性肌力作用。这通过改变RyR活性和降低PLB的磷酸化来实现。

4 靶向NOS治疗心力衰竭

心力衰竭患者中，NO生物利用度和氧化应激功能减低所导致的NOS功能失调是收缩功能障碍、心肌肥厚和心室重构的直接原因。多种治疗方法都尝试去修复心力衰竭患者的NO信号，但收效甚微。如前所诉，对NOS2的抑制有利于降低心力衰竭患者的ONOO-水平。然而，试验已经由于患者的负面影响，最有可能是由于其它NOS同工酶的抑制作用而提前终止。因此，研究并开发一种NOS2抑制剂并且不影响其它NOS同工酶是非常有必要的。另一种方法是广泛增加NO的水平。例如，通过增加血NO浓度，治疗心绞痛、慢性性心力衰竭患者的缺血症状，但由于长期消耗使超氧化物生成逐渐增加而表现出相应的副作用[18]。其结果可能产生更高水平的ONOO-，而对患者更加有害。另一种方法是用药物合理补充BH4来耦合NOS3从而增加NO的含量。不幸的是，BH4在心力衰竭患者中很容易被氧化成BH2并且对NOS3影响有限。也有些化合物（例如奈必洛尔），能够增加NOS3的表达并且防止其解偶联。这些化合物对动物心力衰竭模型和人类细胞系都有积极的影响，但对人类的心力衰竭无效。其他的化合物，如硫化氢可以通过Akt依赖途径增加NOS3活性，这样可能对心力衰竭的治疗有益。其他的方法还可以瞄准NOS3下游蛋白来增加cGMP水平。通过直接应用可溶性鸟苷酸环化酶激活剂（如西那西呱）或使用特定的PDE5抑制剂（如乌地那非、西地那非和伐地那非）。这些化合物均在收缩性/舒张性心力衰竭的患者中进行临床试验并得出了各种测试结果。然而，西那西呱并没有得出任何有益的影响。随着慢性PDE5的逐渐抑制似乎改善了心力衰竭患者心功能和临床状态。一些临床试验目前正在对长效PDE5抑制剂（乌地那非）或其他形式（例如射血分数正常的心力衰竭）的心力衰竭进行测试[19]。因此，通过利用NOS通道操纵其下游蛋白（特别是通过抑制PDE5增加cGMP水平），来达到治疗心力衰竭的目的。

5 结论

NOS信号在心脏功能调节中起着关键的作用。除了其正常的生理调节， NOS功能的变化是心力衰竭综合征的一个主要因素。对每个NOS亚型的表达、定位、活性进行改变，结果导致下游蛋白质功能紊乱，造成了心肌收缩功能障碍和心室重构。通过恢复NO的产生或针对下游机制来解决NOS信号机能失调的各种治疗策略已被提出。然而，在人类心力衰竭模型中仅能获得有限的有益成果，仍需要进一步研究调查。

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（编辑：王宝茹）

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国家自然科学基金（81460039）；吉林省教育厅科研基金（2016-276）；吉林省科技厅青年科研基金（20140520024JH）；吉林省卫生厅青年科研基金（2014Q043）

133000 吉林省延吉市，延边大学附属医院 妇科（金春花），心内科（刘文博、金春子），神经内科（关宏锏）

金春花 主管护师 学士 主要从事妇科疾病与心力衰竭方面研究 Email：38972010@qq.com 通讯作者:金春子 Email：15526771826@163.com

R54

A

1000-3614（2017）08-0830-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.025还原产物次硝酸（HNO）。研究表明，外源性HNO和NO信号具有类似的功能，及对心肌收缩的影响和相似靶蛋白（RYR和SERCA/PLB）[8]。有趣的是，在心力衰竭中这种现象普遍存在。研究表明，HNO对心力衰竭的动物模型具有有益作用，并且可能用于心力衰竭治疗[9]。

2017-03-23）