缺氧对乳腺癌细胞miR－210表达及侵袭能力的影响

郑 健，徐 晶，张雪鹏

(华北理工大学附属医院肿瘤外科，河北 唐山063000)

缺氧对乳腺癌细胞miR－210表达及侵袭能力的影响

郑 健，徐 晶，张雪鹏

(华北理工大学附属医院肿瘤外科，河北 唐山063000)

目的:观察缺氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的变化，探讨缺氧对miR-210表达的影响及与细胞侵袭的关系。方法:实验分为缺氧组和对照组，缺氧组分别以终浓度为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的二氯化钴处理MCF-7细胞24 h，对照组加等剂量磷酸盐缓冲液，采用Transwell技术检测各组的侵袭能力;根据Transwell结果筛选出侵袭力最强的处理组，采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR)检测其与对照组 miR-210的表达。结果:Transwell结果显示不同终浓度的二氯化钴处理(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)后乳腺癌MCF-7细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为(168.60±7.50)、(276.73 ±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87±9.51)个/视野，与对照组(65.60±2.58)个/视野相比均升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。各缺氧组穿膜细胞数组内比较，差异有统计学意义(P＜0.01);且各缺氧组细胞的侵袭能力随缺氧剂加入量的增加逐步增强，呈正相关性(R=0.978，P=0.000)。RT-PCR结果显示200 μmol/L二氯化钴缺氧组miR-210表达水平(7.82±1.53)与对照组(1.00)相比增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论:人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力随微环境缺氧程度的加重而逐步增强，miR-210参与了这一过程。

缺氧;miR-210;乳腺癌;侵袭

乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题，侵袭转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。缺氧微环境普遍存在于多种实体肿瘤中，与肿瘤的发生、发展密切相关，在浸润性乳腺癌，部分乳腺癌细胞直接生存在缺氧微环境中。MicroRNAs(miRNAs)长度大多在19-23个核苷酸，可以在转录后水平抑制靶基因的表达来发挥调控作用。miRNAs在肿瘤发生、发展过程中起至关重要的作用。已有证据表明，miR-210与缺氧相关。本研究利用二氯化钴制作人乳腺癌MCF-7细胞的缺氧微环境，观察癌细胞体外侵袭能力的变化，检测miR-210的表达，探讨miR-210在缺氧条件下与细胞侵袭的关系，期待为乳腺癌的临床治疗提供更有价值的帮助。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所。DMEM细胞培养基购自上海立菲生物技术有限公司。胎牛血清购自BI生物科技公司。Transwell小室购自美国康宁生物科技公司。BD基质胶购自上海前尘生物公司。Trizol裂解液购自美国Ambion生物公司。莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)逆转录试剂盒，SYBR green试剂盒均购自美国Invitrogen公司，miR-210及其内参U6 RNA的引物也由该公司设计并合成。miR-210基因逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 引物序列为5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGG ATACGACTCAGC C-3’，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)上游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAG GT-3’，下游引物序列为5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’。U6基因 RT-PCR引物序列为 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，PCR上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。二氯化钴购自美国Sigma公司。二甲基亚砜购自北京百灵威科技有限公司。4%多聚甲醛固定液购自北京Solarbio科技有限公司。

1.2 MCF-7细胞常规培养 由10%胎牛血清，1%的青霉素-链霉素双抗混合液(10 000 U/mL)及达尔伯克氏必需基本培养基(dulbecco＇s minimum essential medium，DMEM)高糖培养基组成完全培养液，在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中进行MCF-7细胞的培养，每隔1～2 d更换培养液一次，待细胞90%融合时常规传代。

1.3 实验分组 取70%～80%融合的细胞，分为缺氧组和对照组。缺氧组分为4个处理组，依次加入含二氯化钴终浓度为 50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的完全培养液;对照组加入含等剂量磷酸盐缓冲液的完全培养液，两组均置于CO2孵箱中湿润培养24 h，留做Transwell侵袭实验。根据Transwell侵袭实验结果筛选出侵袭力最强的处理组，与对照组一起重复之前的处理过程后，留做PCR实验。

1.3 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 Transwell上室加入100 μL无血清DMEM培养基制备的细胞悬液(密度为5×105个/mL)，下室加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基500 μL，37℃、5%CO2培养箱中培养36 h。取出上室，用棉签轻轻擦去上室未转移细胞和基质胶，切下聚碳酸酯膜，浸入4%多聚甲醛液中固定30 min，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次，常规苏木素染色，中性树胶封片。在100倍倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本随机计数5个视野，以穿过基质膜的细胞总数为指标评价乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力，计算出平均值，每组重复试验3次。

1.4 实时荧光定量PCR检测miR-210基因表达 使用Trizol提取200 μmol/L二氯化钴缺氧组和对照组细胞的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度与浓度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA完整性，以miR-210为目的基因，以U6 RNA为内参照基因，取2 μg浓度和纯度符合要求的RNA，采用特异性茎环引物逆转录后，行RT-PCR检测，体系为20 μL，反应条件为95℃预变性10 min; 95℃ 15 s;58℃ 60 s;72℃ 90 s;45个循环。以2-△△CT(△△CT=△CT缺氧组miRNA-△CT对照组miRNA，△CT=CT miRNA-CT U6 RNA)表示miR-210的相对表达量。重复试验步骤至少3次。

1.5 统计学处理 应用SPSS 17.0软件分析数据，数据以表示，各组细胞穿透基底膜数量比较均采用单因素方差分析(Analysis of single variance，ANOVA)，二氯化钴浓度与各实验组细胞穿透基底膜数量的相关性采用皮尔森相关系数分析，两组乳腺癌细胞miR-210表达量比较采用t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响 不同终浓度的二氯化钴处理组 (50μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)穿膜细胞数分别为(168.60± 7.50)、(276.73±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87± 9.51)个/视野，均高于对照组(65.60±2.58个/视野)，差异有统计学意义(P＜0.01)，各缺氧组穿膜细胞数组内比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。且伴随缺氧剂浓度的升高，细胞侵袭力不断增强，呈正相关性(R= 0.978，P=0.000)。在观测范围内，200 μmol/L二氯化钴处理组穿膜细胞数达到最大，见图1。

2.2 缺氧微环境中miR-210的表达 将对照组miR-210的表达水平定为1.00。同对照组相比，200 μmol/L二氯化钴缺氧组miR-210的表达显著升高，相对表达量为7.82±1.53，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明特异性的缺氧环境可以有效的促进人乳腺癌MCF-7细胞miR-210的表达，见图2。

3 讨论

缺氧是人类实体肿瘤中普遍存在的现象，肿瘤细胞的恶性增殖以及肿瘤组织中血管结构的变异都可以引起肿瘤微环境的缺氧，并且与肿瘤的进展有着密切的关系。二氯化钴可稳定细胞内低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表达，常被用作缺氧诱导剂。本实验采用二氯化钴来模拟机体内真实的缺氧微环境，Transwell侵袭实验结果显示，不同终浓度的二氯化钴处理组(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)穿膜细胞数分别为(168.60±7.50)、(276.73±9.79)、(320.27±8.66)、(516.87±9.51)个/视野，均高于对照组(65.60±2.58)个/视野，且随缺氧程度的升高，穿膜细胞数也逐步增多，表明缺氧微环境有效的促进了乳腺癌细胞的侵袭，且细胞的侵袭能力会随着缺氧的加重而逐步增强，本研究进一步证实缺氧可以导致乳腺癌MCF-7细胞侵袭力增强，且癌细胞的侵袭能力与其所处微环境的缺氧程度二者之间呈正相关，或至少在一定的缺氧程度范围内是正相关的。

缺氧诱导肿瘤细胞侵袭力增强可能涉及多种分子机制，而miRNAs是近些年肿瘤学研究的热点之一，随着研究的深入有望进入临床成为新的治疗靶点。miR-210是一个独立的显著受HIF-1调控的缺氧型核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)分子，低氧引起的miR-210表达的上调与肿瘤及心血管疾病的发生发展关系密切。miR-210与乳腺癌的关系也很密切，有研究发现miR-210在转移性乳腺癌中的表达明显升高［1］。还有研究表明，miR -210在三阴性乳腺癌中显著高表达，这可能与该类患者易出现复发和远处脏器转移有关［2］。Toyama等［3］的研究也证实三阴性乳腺癌患者miR-210的高表达提示预后不良。本实验RT-PCR检测miR-210的变化显示，缺氧组miR-210的相对表达量明显增高，说明缺氧微环境可以有效促进MCF-7细胞miR-210的表达。结合Transwell实验结果可以推论，miR-210参与了在缺氧条件下乳腺癌细胞侵袭力增强这一过程。这些研究提示miR-210可以作为乳腺癌细胞缺氧与否的一种判断指标，进而有望应用于乳腺癌患者的诊断参考及预后评判［4］。张楠等［5］的研究也发现miR-210在乳腺癌组织和细胞中过表达，转染miR-210 inhibitor后乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱，提示miR-210可能会成为乳腺癌治疗的一个新的靶点，而它的抑制剂可能会对乳腺癌的治疗产生重要的作用。

［1］ Volinia S，Galasso M，Sana ME，et al.Breast cancer signatures for invasiveness and prognosis defined by deep sequencing of microRNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109 (8):3024-3029.

［2］ Radojicic J，Zaravinos A，Vrekoussis T，et al.MicroRNA expression analysis in triple-negative(ER，PR and Her2/ neu)breast cancer［J］.Cell Cycle，2011，10(3):507-517.

［3］ Toyama T，Kondo N，Endo Y，et al.High Expression of MicroRNA-210 is an Independent Factor Indicating a Poor Prognosis in Japanese Triple-negative Breast Cancer Patients［J］.Jpn J Clin Oncol，2012，42(4):256-263.

［4］ 陈俊青，王晓稼.微小RNA在乳腺癌转移及预后评估中的作用［J］.肿瘤学杂志，2014，20(3):238-243.

［5］ 张楠，李少遊，巩雅宁，等.miRNA-210对人乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2013，20(3):289-294.

Effect of hypoxia on the ability of microRNA-210 in breast cancer cells to express themselves and invade

ZHENG Jian，XU Jing，ZHANG Xuepeng
(Department of Surgical Oncology，The Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology，Tangshan063000，China)

Objective:To observe the changes of the ability of breast cancer MCF-7 cells to invade under the hypoxic condition and explore the effect of hypoxia on the cellular expression of microRNA-210(imiR-210)and its relationship with cell invasion.Methods:MCF-7 cells were divided into the hypoxia group and the control group.Cobalt chloride(CoCl2)with the concentration of 50 μmol/L，100 μmol/L，150 μmol/L and 200 μmol/L was added in different hypoxia groups，and the same volume of phosphate buffered saline(PBS)was added in the control group for 24h.Transwell technique was used to detect the invasive ability of each group.According to Transwell results，the most invasive group was selected to detect the expression of miR-210 by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:Transwell assay showed that the number of cells which penetrated the artificial basement membrane was 168.60±7.50，276.73±9.79，320.27±8.66，516.87 ±9.51/field respectively in different hypoxic groups(50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L).Compared with that of the control group(65.60±2.58 cells/field)，the number of penetrating cells in each hypoxic group was significantly increased(P＜0.01)，and the difference was also statistically significant within the hypoxic group(P＜0.01).The invasive ability of cells was increased gradually with the increase of the amount of anoxic agent，which was positively correlated with the increase of the concentration of CoCl2(R=0.978，P=0.000).RTPCR assay showed that the expression level of miR-210(7.82±1.53)in the 200μmol/L CoCl2group was significantly increased compared with that of the control group(1.00，P＜0.01).Conclusion:The invasive ability of human breast cancer MCF-7 cells increases gradually with the increase of the degree of hypoxia，and miR-210 is involved in the process.

Hypoxia;MicroRNA-210;Breast cancer;Invasion

2015-09-22)

张雪鹏