微生物热稳定几丁质酶的研究进展

胡荣康,肖 正,林满红,贾瑞博,刘 斌,*

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.国家菌草工程技术研究中心,福建福州 350002;3.福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002)



微生物热稳定几丁质酶的研究进展

胡荣康1,2,肖 正2,3,林满红1,2,贾瑞博1,2,刘 斌1,2,*

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.国家菌草工程技术研究中心,福建福州 350002;3.福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002)

热稳定几丁质酶具有热稳定性和酸碱适应性,能在高温条件下保持良好活性。目前,寻找具有工业化潜在应用价值的新酶源越来越受到关注。本文简述了热稳定几丁质酶的微生物来源,热稳定性机制,及其工业应用和发展前景。

高温微生物,热稳定,几丁质酶,工业应用

几丁质又称甲壳素或甲壳质,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的高分子聚合物,在自然界中是仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质酶是一种能够催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖单体或低分子量几丁寡糖的水解酶。广义的几丁质酶包括壳聚糖酶、脱乙酰酶、几丁寡糖酶等与降解几丁质有关的酶,狭义的几丁质酶指催化水解至少含有一个N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶。几丁质的降解产物壳聚糖、壳寡糖等具有降血糖、降血脂、抗菌、抗肿瘤、调节免疫等活性[1-3]。化学降解法不仅效率低,还会造成严重的环境污染,而利用酶解法可以有效克服这些问题并且能够控制降解程度,具有环境兼容性、成本低等多种优点。X射线衍射图谱分析表明几丁质具有高度有序的晶状结构[4],不溶于水,常温几丁质酶不能轻易地降解几丁质,因此热稳定几丁质酶在工业应用中就更为重要。作为热稳定几丁质酶的重要来源,微生物所产酶在高温条件下反应效率高,污染少,具有更强的抗化学变性和更高的热稳定性,可以在常规嗜温菌中表达且易于纯化[5]。这些特性可以通过基因工程的手段进一步改造获得具有独特生物学特性、更加高效稳定的热稳定酶,使热稳定酶的开发呈现出更加广阔的前景。本文对热稳定几丁质酶的微生物来源,热稳定性机制,及其工业应用和发展前景进行综述。

1 几丁质酶的特性

几丁质酶根据氨基酸同源性可分为18和19两个家族,18家族几丁质酶广泛存在于各种生物中,而植物和链霉菌属几丁质酶多属于19家族,18和19家族几丁质酶在氨基酸序列上没有同源性。微生物几丁质酶在pH3～10之间都能保持活性,对温度适应性强,一般在4～60 ℃之间都较稳定,金属离子Fe3+、Fe2+、Zn2+会抑制酶的活性,Mg2+和Mn2+能激活酶的活性[6]。

表1 热稳定几丁质酶的来源

目前可以在NCBI数据库中检索到8种几丁质酶的三维结构图。19家族几丁质酶三级结构类似于溶菌酶。18家族几丁质酶三维结构相似,以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)分离的几丁质酶为代表,都具有8条链的α/β折叠桶构成,8条β片段弯进桶内与α螺旋形成一个外向环。

2 热稳定性几丁质酶的来源

目前,从细菌[7]、真菌[8]、古菌[9]中均有分离热稳定几丁质酶的报道,见表1。

2.1 嗜热真菌几丁质酶

嗜热真菌是一类分布比较广泛的真菌类群,目前从地球各温带以及湿润区和干旱区均发现有嗜热真菌,只要存在高温环境并满足一定的营养条件,均适合嗜热真菌的生长发育[10]。

来源于嗜热真菌的热稳定几丁质酶的研究中,疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)在微生物研究和工农业生产中显示出极高的应用价值。疏绵状嗜热丝孢菌是生长上限温度高的一种嗜热真菌,它在几丁质诱导下产生的胞外几丁质酶具有很高的抗菌活性[11]。最近测序的T.lanuginosusSSBP基因组中,编码44.1 ku蛋白质的ChitⅠ基因和编码36.6 ku蛋白质的ChitⅡ基因在巴斯德毕赤酵母中成功表达,ChitⅠ在50 ℃有最适温度,而在60 ℃处理30 min后仍然保留56%的活性;编码343个氨基酸的ChitⅡ在40 ℃活性最佳,在50 ℃处理60 min后仍保留71%的活性[12]。ChitⅡ显示出对青霉菌和黑曲霉具有抗真菌特性,它含有8条α/β链折叠桶结构,对其分子结构分析表明Glu176对该酶活性至关重要[13]。郭润芳和李多川[14]克隆了T.lanuginosus的几丁质酶基因,在甲醇和胶体几丁质的诱导下,在毕赤酵母GS115中成功分泌出具有生物活性的几丁质酶,诱导6 d后酶活性达2.261 U/mL,酶蛋白表达量0.36 mg/mL,得到的几丁质酶最适反应温度为60 ℃,65 ℃处理30 min仍有70%的相对酶活。几年后,他们又从T.lanuginosusSY2分离了一种新型胞外几丁质酶,这种耐热几丁质酶在50 ℃稳定存在,在65 ℃下半衰期为25 min,这是目前从真菌中分离的最耐热的几丁质酶之一[15]。通过诱变和基因工程的手段改造产酶菌株有利于提高微生物产几丁质酶能力与产酶水平,如果对这些基因做进一步改造,并实现异源高效表达,或许可以获得优良的生物工程菌株。从溶黄嘌呤厄菌(Oerskoviaxanthineolytica)NCIM 2839中发现一种热稳定几丁质酶,可以通过麦麸和胶体几丁质生产真菌原生质体,这种简单、经济的方法可以应用于改进真菌原生质体融合的生物技术产业[16]。

尽管不断从真菌中分离出热稳定几丁质酶,但是真菌几丁质酶在工业化生产方面受到诸多限制,如真菌菌丝体与不溶性底物难以混合,菌丝体易向发酵系统中转移等等。为了进一步提高真菌几丁质酶热稳定性,利用重组微生物以及国外最近利用苯基琼脂糖矩阵等固定化技术均使几丁质酶表现出更好的热稳定性[17-18]。

2.2 嗜热细菌几丁质酶

嗜热细菌对温度的耐受性极强,在恶劣的条件下为了生存会采取各种各样的分子策略,例如有人从印度沙漠中分离到一株产高水平嗜热几丁质酶的细菌BrevibacillusformosusBISR-1,即便在100 ℃高温下也能保持活性5 h[19]。在湿地等地热环境中也能够获得分泌几丁质酶的嗜热细菌[20]。目前世界各地的科学家不断从高温生态环境中分离到产几丁质酶的嗜热菌[7]、超嗜热菌[21]。嗜热细菌几丁质酶最适温度多在40～60 ℃,对酸碱度及温度的适应性强,在生物技术产业方面有重大的应用潜力。

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芽孢杆菌(Bacillusspp)在自然界分布广泛,地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)在芽孢杆菌中较具应用潜力且具有很强的酶活性,是国内外几丁质酶研究的热点菌种。Waghmare等[22]从蘑菇床中分离了一种产新型耐热几丁质酶的地衣芽孢杆菌JS,用DEAE纤维素离子交换层析法纯化后纯度提高了8.1倍,55 ℃时酶活性最佳,这种热稳定性酶在转化废弃几丁质及生产低聚糖等方面具有重要意义。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)用于防治植物病原真菌在国内外已有不少研究,赵静等[23]运用基因工程手段成功克隆表达了B.subtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因,酶蛋白具有较好的耐热性,研究发现该酶在高温下对根肿病菌孢子有一定的裂解作用,在121 ℃处理20 min后仍然具有抑菌活性。从海床表面细菌获得的一种新嗜热几丁质酶(LpChiA)在70 ℃稳定性较强,通过阴阳离子和非离子表面活性剂预培养后酶活提高了60%,有趣的是,所有类型的表面活性剂均能增强酶的活性[24]。表面活性剂的激活机制目前尚不清楚,但是对晶体结构的分析将有助于阐明表面活性剂的激活机制。

最近生物技术的进步使许多细菌几丁质酶得到克隆,表达和纯化。与几丁质降解有关的知识和方法已经用于生产化工产品,对几丁质降解的进一步探究需要继续探索新酶,提高酶的质量,以及进行高通量几丁质酶实验。

2.3 嗜热古菌几丁质酶

在地球的生命形式中,嗜热古菌出现最早因而受到各领域学者的重视,目前对嗜热古菌的研究多以极端嗜热古菌为主,其最高生长温度为80～110 ℃,最低生长温度为55 ℃[25]。16S/18S进化树分析表明,极端嗜热菌通常位于树根部位,可能代表着古老细胞的生命特征[26],这对于开发热稳定几丁质酶及拓展其工业应用具有重要的参考价值。

在对嗜高热古菌PyrococcuskodakaraensisKOD1的研究中,Tanaka[27]分离到了抗热性很强的几丁质降解酶,克隆该几丁质酶基因chiA并对其序列分析表明,该序列长3645 bp,编码1215个氨基酸,蛋白质分子量为134.259 ku,该酶最适作用温度是85 ℃,但是在100 ℃处理3 min后就会失活;然而其缺失C端的同系物ChiAΔ2在100 ℃处理3 h后仍保留70%的酶活力,具有极强的耐热性,该同系物的发现极大拓展了几丁质酶的应用范围。

Mine[28]从海床强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)分离的几丁质酶能够降解甲壳素并生成最终产物壳二糖,通过分析降解机制,脱乙酰酶作为一个不溶性的包涵体经过再折叠得到重新激活,经过多次分离纯化,从1 L培养液中获得40 mg可溶性热稳定脱乙酰酶,80 ℃下仍具有活性。Nakamura等[29]对P.furiosus几丁质酶的三级结构进行了分析,其结果提供了一个结构蛋白和碳水化合物识别的新认识,这为生物量的发展提供了一个新技术。

3 热稳定机制

酶的分子结构特点是决定其热稳定性的主要机制。通过对酶蛋白序列分析,热稳定几丁质酶之所以表现出比常温酶更强的耐热性,除了氨基酸排列的一级基础,通过疏水作用、氢键、离子键和疏水作用等次级键再折叠成的二、三级结构也有利于酶在高温环境下发挥催化功能。

18家族几丁质酶三维结构相似,以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)分离的几丁质酶为代表,都具有8条链的α/β折叠桶构成,8条β片段弯进桶内与α螺旋形成一个外向环。Lin等人通过特定PCR技术克隆了S.marcescensChiC和它的两个C端截断的突变体G426和G330的基因。G426来自于没有C端结合域的SmChiC分子,而G330来自于同时没有C端结合域和纤连蛋白Ⅲ域(FnⅢ)的SmChiC分子,圆二色光谱数据表明,突变体和SmChiC拥有类似的折叠结构,然而G330不同于G426的是,G330的热稳定性没有较大的转变,这说明FnⅢ在SmChiC热稳定中起到至关重要的作用[31]。

与酶热稳定性相关的非共价力如氢键、离子键和疏水作用都会使酶蛋白具有更加稳定的空间结构,一般认为,当这些作用力增加时,酶的热稳定性也会随之增强,反之减弱。疏水作用能够形成一个蛋白质疏水核心紧密包裹蛋白质核心,是蛋白质折叠的主要驱动力。蛋白质的热稳定性和氢键的数量有关,氢键能为酶构象的稳定提供110 kcal/mol的能量。形成网络的离子对会比同等数量的单个离子在能量上更有利。一般认为二硫键使酶蛋白稳定的原因是它能降低折叠状态的熵,形成二硫键的两个半胱氨酸之间间隔的氨基酸数量的对数与二硫键对熵值的影响呈正比。

大多数几丁质酶都有其固有的热稳定性,而一些从高温菌中分离到的几丁质酶因为水解底物的不同其热稳定性也会产生变化,例如从Thermoascusaurantiacusvar. levisporus和Chaetomiumthermophilum获得的几丁质酶基因转化毕赤酵母后,在高温下水解胶体几丁质和粉状甲壳素、壳聚糖时酶活性持久不变[32]。近年来基因工程和蛋白质工程技术越发完善,增强了酶的热稳定性,同时固定化技术和化学修饰也为优化几丁质酶的热稳定性提供了新途径。

4 热稳定几丁质酶的应用进展

热稳定酶能在高温条件下保持良好活性,有特殊的耐受和催化功能,适应范围较广,且对一些酶抑制剂耐受性明显,生物学性质稳定,有利于工业化应用。由于热稳定几丁质酶具有高温反应活性,使其在虾蟹壳资源利用、食品开发与生物医药、农业防治、生物质能源等方面有广泛的应用潜力。

4.1 在虾蟹壳资源开发中的应用

我国海岸线漫长,虾蟹资源非常丰富,然而每年有大量几丁质资源废弃,不仅给环境造成巨大污染,同时造成了严重的资源浪费。再生利用这些废弃资源及生产高附加值产品已成为近年来的热点话题。酶解几丁质具有环境兼容性好,成本低等优点。虾蟹壳几丁质在酶解之前,要经过酸碱处理,这就要求几丁质酶要具备耐热、耐酸碱等多种特性。目前,国外对超微粉碎小龙虾壳并与酶解相结合的处理方法进行了研究,该研究从100 g小龙虾壳酶解36 h后得到15.2 g葡萄糖,这与单一方法处理相比得率大大提高[33]。使用基因工程重组几丁质酶酶解黑虎虾虾壳,提供了一种高效环保的壳寡糖制备方法,为环境清洁型的龙虾壳寡糖工业化生产打下基础[34]。

4.2 在食品开发与生物医药中的应用

甲壳素、壳聚糖被誉为人体所必需的除了糖类、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质以外的第六大生命要素。低聚壳聚糖不仅在调节微生态等方面效果显著,同时还能降低胆固醇、血脂和血糖。低聚壳聚糖无急性毒性,无细胞毒性,亚急性毒性非常小,但是化学获得法易产生化学残留,同时不能控制降解程度。热稳定几丁质酶高温反应性好,具有综合抗性,能高效获得低聚壳聚糖等几丁质降解产物,比常温酶更加适合大批量工业化生产,例如从芽孢杆菌和类芽孢杆菌分离的富有活性的几丁质酶同工酶,在海洋甲壳类食物甲壳素转化方面应用显著[35]。在医药学领域,通过微生物的生物降解作用,可制备耐高温杀菌的医用材料,如壳聚糖类的手术缝合线、医用敷料、组织修复材料等[36]。壳聚糖酶能够降解壳聚糖获得具有独特生理功能的壳寡糖,壳寡糖具有提高免疫力,抑制癌细胞增长以及预防成人疾病等功能,大多数微生物产的壳聚糖酶具有较好的热稳定性,最适温度范围在30～70 ℃。但是,目前商品壳聚糖酶在热稳定性等方面尚不满足大规模工业化生产,如何向医药工业提供更加廉价高效的壳聚糖酶,在世界范围都已经展开了广泛研究。

4.3 在农业防治中的应用

病害是制约农作物高产稳定的主要因素之一,水稻是世界上重要的粮食作物,水稻纹枯病是水稻生产上普遍发生的一种世界性真菌病害,从粉红聚端孢菌(Trichotheciumroseum)克隆嗜热几丁质酶基因以农杆菌转化法转入水稻基因组中,增强了水稻的抗逆性。与此同时,Karabi等[37]向水稻引入了一个PR-3几丁质酶基因,转化株合成不同层次的耐热几丁质酶蛋白,对纹枯病表现出不同程度的抗性增强。根肿病是世界范围内的土传植物病害,近年来我国十字花科根肿病覆盖程度逐年严重,造成了作物大量减产,对十字花科根肿病具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌XF-1已经被成功分离,该菌分泌的热稳定几丁质酶高效地提高了植物的抗病性,同时该菌也是最具防病潜力和应用价值的一类生防菌[23]。

4.4 在生物质能源中的应用

石油等石化燃料在帮助人类物质文明发展的同时也对人类及全球环境造成了巨大危害,酶生物燃料生物相容性好,适用范围广泛,作为一种可再生的绿色能源其综合潜力已经被广泛讨论。从链霉菌属CS147获得的胞外几丁质酶作为生物燃料具有将废料转化为简单糖的潜能,反应机理主要是通过酶反应生成N-乙酰葡糖胺单体并进一步水解产生酒精[38]。利用宏基因组技术提高酶生物质能转换,有助于扩大生物燃料在商业生产中的应用范围[39]。

5 问题与展望

自然界赋予了热稳定几丁质酶耐高温和极强分子稳定性的特性,但由于热稳定几丁质酶的来源有限,培养条件苛刻,限制了热稳定几丁质酶的广泛应用,寻找具有工业化潜在应用价值的新酶源越来越受到关注。目前人们在筛选产酶活力高、稳定、潜力大的优良菌株的同时也通过诱变和基因工程来改造产酶菌株,通过这些方式以提高几丁质酶的性能、产酶水平、活力等。在基因工程技术使热稳定几丁质酶大规模生产和应用的同时,通过定向进化、固定化技术、表面活性剂等方面提高酶活性也逐渐成为研究的热点。对热稳定几丁质酶高级结构的进一步认识将为建立几丁质酶克隆表达体系及定向进化等方面提供参考。以基因组序列信息结合分子遗传学产生的新工具,使极端嗜热微生物的生物技术超越单级的生物转化成为可能。虽然在过去的二十年中发现新微生物的速度已经放缓,基因组序列数据为新的生物分子和代谢途径提供了线索,开拓了新应用的范围。此外,最近的极端嗜热微生物的分子遗传学的进步使得高温应用代谢工程成为现实[40]。随着不断分离出新型嗜热菌以及对热稳定酶反应条件的探索,热稳定几丁质酶的应用前景必将更加广阔。

[1]Shahid M. Induction of chitinase,β-glucanase,and xylanase taken fromTrichodermasp. on different sources:A Review[J]. African Journal of Microbiology Research,2014,8(34):3131-3135.

[2]Andrea F,Carmen F,Giovanni U,et al. New chitosan salt in gastro-resistant oral formulation could interfere with enteric bile salts emulsification of diet fats:preliminary laboratory observations and physiologic rationale[J]. Journal of Medicinal Food,2014,17(6):723-729.

[3]Kumar BTN,Murthy HS,Patil P. Enhanced immune response and resistance to white tail disease in chitin-diet fed freshwater prawn,Macrobrachiumrosenbergii[J]. Aquaculture Reports,2015,2:34-38.

[4]Kumari S,Rath P,Kumar A S H,et al. Extraction and characterization of chitin and chitosan from fishery waste by chemical method[J]. Environmental Technology & Innovation,2015,3:77-85.

[5]Tompa D R,Gromiha M M,Saraboji K. Contribution of main chain and side chain atoms and their locations to the stability of thermophilic proteins[J]. Journal of Molecular Graphics & Modelling,2016,64:85-93.

[6]郭玉莲. 微生物几丁质酶及其在植物病害防治中的作用[J]. 中国农学通报,2005,21(1):283-285.

[7]Yang S,Fu X,Yan Q. Cloning,expression,purification and application of a novel chitinase from a thermophilic marine bacteriumPaenibacillusbarengoltzii[J]. Food Chemistry,2016,192:1041-1048.

[8]Jankiewicz U,Brzezinska M S. Purification,characteristics and identification of chitinases synthesized by the bacteriumSerratiaplymuthicaMP44 antagonistic against phytopathogenic fungi[J]. Applied Biochemistry & Microbiology,2015,51(5):560-565.

[9]Belén G F,Silva A F D,Jacobo L S,et al. Functional expression and characterization of a chitinase from the marine archaeonHalobacteriumsalinarumCECT 395 inEscherichiacoli[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2014,98(5):2133-2143.

[10]Van d B J,Facun K,De V M,et al. Thermophilic growth and enzymatic thermostability are polyphyletic traits within Chaetomiaceae[J]. Fungal Biology,2015,119(12):1255-1266.

[11]Khan F I,Bisetty K,Singh S,et al. Chitinase fromThermomyceslanuginosusSSBP and its biotechnological applications[J]. Extremophiles,2015,19(6):1055-1066.

[12]Zhang M,Puri A K,Govender A,et al. The multi-chitinolytic enzyme system of the compost-dwelling thermophilic fungusThermomyceslanuginosus[J]. Process Biochemistry,2015,50(2):237-244.

[13]Khan F I,Govender A,Permaul K,et al. Thermostable chitinase II fromThermomyceslanuginosusSSBP:Cloning,structure prediction and molecular dynamics simulations[J]. Journal of Theoretical Biology,2015,374:107-114.

[14]郭润芳,史小琴,李多川,等. 一种耐热几丁质酶的产生及其稳定性研究[J]. 微生物学通报,2008,35(4):481-485.

[15]Guo R F,Shi B S,Li D C,et al. Purification and Characterization of a Novel Thermostable Chitinase fromThermomyceslanuginosusSY2 and Cloning of Its Encoding Gene[J]. Agricultural Sciences in China,2008,7(12):1458-1465.

[16]Waghmare S R,Kulkarni S S,Ghosh J S. Chitinase production in solid-state fermentation fromOerskoviaxanthineolyticaNCIM 2839 and its application in fungal protoplasts formation[J]. Current Microbiology,2011,63(3):295-299.

[17]Prasad M,Palanivelu P. Immobilization of a thermostable,fungal recombinant chitinase on biocompatible chitosan beads and the properties of the immobilized enzyme[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry,2015,62(4):523-529.

[18]Prasad M,Palanivelu P. A novel method for the immobilization of a thermostable fungal chitinase and the properties of the immobilized enzyme[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry,2014,61(4):441-445.

[19]Meena S,Gothwal R K,Mohan M K,et al. Production and purification of a hyperthermostable chitinase fromBrevibacillusformosusBISR-1 isolated from the Great Indian Desert soils[J]. Chinese & Foreign Medical Research,2014,18(2):451-462.

[20]Liu P,Cheng D,Miao L. Characterization of Thermotolerant Chitinases Encoded by aBrevibacilluslaterosporusStrain Isolated from a Suburban Wetland[J]. Genes,2015,6(4):1268-1282.

[21]Haruyuki A,Takaaki S,Tamotsu K. Application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,22(5):618-626.

[22]Waghmare S R,Ghosh J S. Chitobiose production by using a novel thermostable chitinase fromBacilluslicheniformisstrain JS isolated from a mushroom bed[J]. Carbohydrate Research,2010,345(18):2630-2635.

[23]赵静,熊国如,王志远,等. 枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑菌活性[J]. 中国生物防治学报,2011(4):504-509.

[24]Shibasaki H,Uchimura K,Miura T,et al. Highly thermostable and surfactant-activated chitinase from a subseafloor bacterium,Laceyellaputida[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2014,98(18):7845-7853.

[25]盛多红. 超嗜热古菌基因组的热稳定性[J]. 生命科学,2014(1):64-71.

[26]Wolferen M V,Ajon M,Driessen A J M,et al. How hyperthermophiles adapt to change their lives:DNA exchange in extreme conditions[J]. Extremophiles,2013,17(4):545-563.

[27]Tanaka T,Fujiwara S,Nishiori S,et al. A unique chitinase with dual active sitesand triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeonPyrococcuskodakaroensisKOD1[J]. Applied Environmental Microbiology,1999,65(12):5338-5344.

[28]Mine S,Ikegami T,Kawasaki K,et al. Expression,refolding,and purification of active diacetylchitobiose deacetylase fromPyrococcushorikoshii[J]. Protein Expression & Purification,2012,84(2):265-269.

[29]Nakamura T,Mine S,Hagihara Y,et al. Tertiary structure and carbohydrate recognition by the chitin-binding domain of a hyperthermophilic chitinase fromPyrococcusfuriosus[J]. Journal of Molecular Biology,2008,381(3):670-680.

[30]Haruyuki A,Takaaki S,Tamotsu K. Application of hyperthermophiles and their enzymes[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,22(5):618-626.

[31]Fu-Pang L,Chun-Yi W,Hung-Nien C,et al. Effects of C-terminal domain truncation on enzyme properties ofSerratiamarcescensChitinase C[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(8):3617-3627.

[32]Li A,Yu K,Liu H. Two novel thermostable chitinase genes from thermophilic fungi:Cloning,expression and characterization[J]. Bioresource Technology,2010,101(14):5546-5551.

[33]Gao C,Zhang A,Chen K,et al. Characterization of extracellular chitinase fromChitinibactersp. GC72 and its application in GlcNAc production from crayfish shell enzymatic degradation[J]. Biochemical Engineering Journal,2015,97:59-64.

[34]Proespraiwong P,Tassanakajon A,Rimphanitchayakit V. Chitinases from the black tiger shrimp Penaeusmonodon:Phylogenetics,expression and activities[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2010,156(2):86-96.

[35]Li X,Xu Z,Gang Z,et al. Molecular characterization and expression analysis of five chitinases associated with molting in the Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2015,187:110-120.

[36]李靓. 壳聚糖制备工艺及其在医药领域的研究进展[J]. 现代医药卫生,2012,28(11):1687-1688.

[37]Datta K,Tu J,Oliva N,et al. Enhanced resistance to sheath blight by constitutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars[J]. Plant Science An International Journal of Experimental Plant Biology,2001,160(3):405-414.

[38]Pradeep G C,Yoo H Y,Cho S S,et al. An Extracellular Chitinase fromStreptomycessp. CS147 Releases N-acetyl-D-glucosamine(GlcNAc)as Principal Product[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2015,175(1):372-386.

[39]Xing M N,Zhang X Z,He H. Application of metagenomic techniques in mining enzymes from microbial communities for biofuel synthesis[J]. Biotechnology Advances,2012,30(4):920-929.

[40]Frock A D,Kelly R M. Extreme Thermophiles:Moving beyond single-enzyme biocatalysis[J]. Current Opinion in Chemical Engineering,2012,1(4):363-372.

Research progress on thermophilic microorganism chitinase

HU Rong-kang1,2,XIAO Zheng2,3,LIN Man-hong1,2,JIA Rui-bo1,2,LIU Bin1,2,*

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China; 3.College of Life Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Thermophilic chitinase has thermal stability and pH adaptability to achieve expectation under harsh conditions,thus enjoys a better application prospect. At present,it is more and more concerned to find new enzyme sources with potential value for industrial application. In this paper,various resources and thermal stability mechanisms of thermophilic chitinase were reviewed,followed by its industrial applications and development prospects.

thermophilic microorganism;thermostable;chitinase;industrial application

2016-04-14

胡荣康(1992-)，男，在读硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：18750126626@163.com。

*通讯作者:刘斌(1969-)，男，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：liubin618@hotmail.com。

国家科技支撑计划子课题(2014BAD15B01)；福建省科技重大专项(2014NZ2002-1)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0359-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.062