前蛋白转化酶枯草溶菌素9及其抑制剂的研究进展

陈丽 廉姜芳 周建庆

前蛋白转化酶枯草溶菌素9及其抑制剂的研究进展

陈丽 廉姜芳 周建庆

前蛋白转化酶（PCs）在维持人体的稳态中起着重要作用，同时参与一系列病理生理过程。前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）是PCs家族的重要成员之一，参与糖脂代谢,神经系统的凋亡和分化，并在肿瘤的发生、发展中起到一定的作用。同时，大量的基础和临床研究已证实，PCSK9抑制剂能明显降低血LDL-C水平，从而减少心血管事件的发生。现就PCSK9的研究成果，尤其在多种疾病中的功能作一综述，并阐述PCSK9抑制剂的临床研究进展。

PCSK9 脂代谢 PCSK9抑制剂

前蛋白转化酶（proproteinconvertases,PCs）是一类钙离子依赖的丝氨酸内切酶，其基本功能是对前体蛋白的一个或多个内在位点进行水解从而将其激活[1-3]。2003年Seidah等[3]首先发现了一种新的PCs成分，其主要在肝脏合成，前体由692个氨基酸组成，在内质网裂变和自动催化后合成可溶性酵素酶，继而通过细胞的分泌通道被释放到血液中，命名为神经凋亡调节转换酶1（NARC1），是PCs家族新成员。同年Abifadel等[4]观察到2例NARC1基因功能获得性变异患者血胆固醇明显升高和早发心血管死亡，发现这是除低密度脂蛋白受体(LDLR)、ApoB外，第三个与常染色体显性家族性高胆固醇血症相关的基因，此研究结果发表在Nature Genetics上，此后NARC1正式更名为前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）。已有大量研究证实PCSK9对血脂调节的影响，其与家族性高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征等疾病密切相关。但近几年的研究发现，PCSK9在神经系统疾病和肿瘤等疾病中也起到重要的作用。由此可见，对PCSK9的研究日趋深入和广泛，因而有必要对PCSK9的研究进展作一综述。

1 PCSK9的结构、分布及其表达调节

PCs家族在哺乳动物中共有9个成员，它们是PC1/ 3、PC2、弗林蛋白酶（Furin）、PC4、PC5/6（含A和B两个亚型）、PACE4和PC7以及两个非碱性氨基酸特异性的转化酶SK-1/S1P和NARC-1/PCSK9。NARC1/PCSK9是由PCSK9基因所编码，由692个氨基酸构成，属于枯草蛋白酶中蛋白酶K亚家族的成员，基因定位于1p34.1-p32，全长29kb，由12个外显子构成，编码区约为2kb，其氨基酸序列可分为信号肽（1-30）、前片段（31-147）、催化域（148-425）、p2域和富含半胱氨酸的碳末端（526-692）几个结构域[5]。

PCSK9表达于肝细胞、神经细胞、肾间质细胞、小肠结肠上皮细胞和胚胎细胞等，其中对肝细胞和神经细胞的增值、分化起到重要作用[6]。Labonte等[7]发现PCSK9可下调丙型病毒性肝炎受体，LDLR以及跨膜蛋白CD81。PCSK9对肾间质细胞和肠细胞的调节缺乏相关报道。

2 PCSK9与脂质代谢、动脉粥样硬化

已知冠心病与多种遗传因素有关，尤其是参与脂代谢的多个基因在冠心病的发生、发展中起重要作用，而血管内皮下LDL-C的沉积是冠心病的主要病理基础。近年研究发现，PCSK9对胆固醇代谢有重要调节作用，并可能直接或间接的参与冠心病的发生、发展[8]。Denis等[9]在高脂高胆固醇喂养的小鼠模型中发现，PCSK9基因失活显著降低主动脉的胆固醇酯，PCSK9基因过表达促进动脉粥样硬化的发展。目前较为认可的机制是PCSK9通过调节肝脏脂质代谢进而影响血脂从而间接参与动脉粥样硬化。正常代谢过程是LDL-C通过肝细胞LDLR的内吞作用在溶酶体内降解，LDLR重新循环至肝细胞表面再发挥降低LDL的作用。而PCSK9通过结合于肝细胞LDLR的表皮生长因子（EGF）样结构域，与LDL共同内化，抑制LDLR的释放与返回细胞膜，诱导LDLR进入溶酶体内降解，导致细胞表面LDLR数量的减少，最终将导致血LDL-C的水平升高[10]。每个LDLR可再循环150次，因此PCSK9引起的LDLR的轻度下调可致LDL-C的巨大改变。

也有学者认为细胞内低胆固醇激活细胞内固醇调节元件结合蛋白2（SREBP-2），从而促进LDLR基因的表达，使循环中的LDL-C减少。但与此同时SREBP-2也促进PCSK9的表达，使LDLR下调，从而抑制肝胆固醇吸收并增加血循环中LDL-C[11-12]。然而Brown和Carious等[13-14]研究认为PCSK9对血管壁的直接作用在动脉粥样硬化发生、发展中发挥重要影响，具体作用及机制仍不详，有待于进一步研究。有趣的是，在动脉粥样硬化发病机制中，PCSK9除调节脂质代谢外，还可能参与炎症反应、内皮损伤、血流动力学改变、糖代谢等病理生理过程[15-20]。

已发现PCSK9基因突变分为两种类型：功能缺失型和功能获得型分别与低胆固醇血症和高胆固醇血症相关。功能获得型突变可增强PCSK9上调LDL-C的能力，导致高胆固醇血症，主要形式有S127R、D129G和E670G等[4,21]，功能缺失型突变可削弱或灭活PCSK9上调LDLC的能力，导致低胆固醇血症，主要形式有R46L、G106R和C679X等,以携带Y142X和C679X的杂合子缺失型突变携带者为例，相比于非携带者，LDLC水平下降28%，冠心病的发生率下降88%[22]。以上发现提示，抑制PCSK9功能是一种降低LDL-C水平的有效策略。因此，PCSK9作为新的降脂靶点越来越受到关注。虽然临床上他汀类药物的应用极其广泛，但它仍有一定的局限性。首先，他汀类药物的不良反应有：肝脏、肌肉等损害；其次，他汀类药物对于治疗家族性高胆固醇血症效果不理想。最重要的是，他汀类药物的6%法则即单用他汀类药物的降脂效果不够理想，但即使加大他汀类药物的使用剂量其降脂能力也只能增加6%左右[23]。Dubuc等[24]和Careskey等[25]研究显示，他汀类药物在升高LDLR的过程中可能反馈性的使PCSK9的表达增加从而产生了一定的拮抗作用,这也在一定程度上解释了他汀类药物的6%法则。

大量的基础和临床研究均已证实，PCSK9抑制剂能显著降低血LDL-C水平，且耐受性和安全性良好。2007年，第一个PCSK9抑制剂诞生，之后多种不同途经的PCSK9抑制剂相继出现，主要包括：（1）抑制PCSK9的合成：反义寡核苷酸（ASOs）、小分子干扰RNA（siRNA）；（2）抑制PCSK9与LDL-R的结合：单克隆抗体、小分子多肽。其中单克隆抗体类药物发展最快，以PCSK9为靶标的单克隆抗体可以与PCSK9发生特异性结合，阻断PCSK9与LDLR的相互作用，减慢LDLR的降解过程从而发挥降低LDL-C水平的作用。目前热门研究的药物为Amgen公司的Evolocumab（AMG-145）和Regeneron/Sanofi公司 Alirocumab（REGN-727/SAR-236553），已进入Ⅲ期临床试验[26]。

DESCARTES-2[27]研究随访52周纳入901例接受大剂量他汀治疗后LDL-C＞75mg/dl的非冠心病或冠心病患者，参与者随机接受每4周1次的Evolocumab 420mg或安慰剂治疗，参与者同时还分别接受单独饮食调整、阿托伐他汀10mg及饮食调整、阿托伐他汀80mg或阿托伐他汀80mg+依折麦布10mg的基础治疗。到第52周，Evolocumab使低心血管风险和冠心病患者的LDL-C水平降低57%，超过安慰剂[27]。

GLAGOV研究纳入197个中心的968例症状性冠状动脉疾病患者，484例患者在他汀治疗基础上随机接受Evolocumab（皮下注射420mg，每月1次）治疗，484例患者应用安慰剂治疗，治疗时间为76周。最终846例患者完成随访。采用血管内超声（IVUS）评估斑块进展或消退情况。主要终点是治疗78周后相对基线的斑块体积百分比（PAV）变化，次要终点包括斑块总体积（TAV）变化、斑块逆转的患者百分比。试验结果显示，治疗78周后，安慰剂组达到的平均LDL-C水平为93.0mg/dl，相对于基线降低3.9%；Evolocumab组LDL-C水平则达到36.6mg/dl，较基线下降59.8%，差异十分显著。Evolocumab组PAV减小0.95%，安慰剂组无明显变化（P＜0.01）。Evolocumab组TAV缩小5.8mm3，安慰剂组缩小0.9mm3，两组差异明显（P＜0.01）。Evolocumab组64.3%的患者显示出斑块逆转，安慰剂组的比例为47.3%。此外，研究尚未发现平均LDL-C达到36.6mg/dl水平时有安全性问题；新发糖尿病、肌痛或神经认知不良反应也未增加[28]。

Alirocumab成为第一个获得FDA批准的PCSK9抑制剂。16项Ⅲ期临床试验来评估Alirocumab的安全性及有效性，部分试验已被注册或完成。ODYSSEY COMBOⅡ研究评估720例心血管事件高危且使用了最大耐受剂量他汀的患者使用Alirocumab的有效性和安全性。Alirocumab用法为：75mg注射，每2周1次，如果8周时LDL-C水平＞70mg/dl剂量增加至150mg注射，每2周1次。对照组接受最大耐受剂量他汀和依折麦布10mg/d，及安慰剂。结果显示，Alirocumab组患者LDL-C水平较基线降低了50.6%，依折麦布组患者降低了20.7%（P＜0.01）。24和52周时，Alirocumab组LDL-C水平分别为51.6、53.3mg/dl[29]。

ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ研究共有735例杂合子家族性高胆固醇血症患者，接受了最大耐受剂量他汀但LDL-C水平未达到＜70mg/dl（有心血管疾病史）或者＜100mg/dl（无心血管疾病史），将这些患者随机分配到Alirocumab组（75mg每2周1次）或安慰剂组；如果8周时LDL-C水平＞70mg/dl剂量增加至150mg注射，每2周1次。结果表明，患者LDL-C水平较基线降低了近49%，接近40%的杂合子家族性高胆固醇血症患者接受了150mg剂量的Alirocumab。24和52周时，患者的平均LDL-C水平为70mg/dl[30]。

ODYSSEY Long-Term研究评估2 341例家族性高胆固醇血症患者或者心血管事件高危患者使用Alirocumab的有效性和安全性，这些患者接受了最大耐受剂量他汀治疗但LDL-C水平＞70mg/dl。患者被随机分配到Alirocumab组（150mg，每2周1次）或安慰剂组。主要疗效终点为24周时LDL-C水平的下降，次要终点为12和24周时LDL-C水平基线变化百分比及其他血脂水平。结果显示，24周时Alirocumab组LDL-C水平下降61%，而安慰剂组升高0.8%。这结果与完整试验结果一致，78周时LDL-C下降58%。同时，Alirocumab组相比于安慰剂组血清TG水平和脂蛋白a水平明显下降，HDL-C水平升高。Alirocumab组的心血管不良事件发生率低于安慰剂组[31]。

ODYSSEY OUTCOMES研究纳入18 000例急性冠脉综合征患者，将会被随机分配到最佳药物治疗组或最佳药物治疗组+Alirocumab组，随访时间长达2年，将在2017年底完成。若ODYSSEY OUTCOMES研究显示心血管的获益，Alirocumab的适应证将进一步扩大[29]。

短期研究显示，单克隆抗体药物降低LDL-C的幅度超过50%，这一降幅相当于大剂量的强效他汀类药物治疗，且安全性和耐受性良好。但目前已公布的研究周期较短、样本量小、缺乏长期安全性和有效性的证据，因此有待于进一步的大量临床研究验证。有4项PCSK9抑制剂大规模临床预后试验正在进行中，包括ODYSSEY OUTCOME、FOURIER、SPIRE-1和SPIRE-2，共纳入70 000研究对象，均为急性冠脉综合征后LDL-C＞70mg/dl的高危心血管患者，观察3～4年，大部分研究结果预计在2017年底前后公布。该研究结果的公布将进一步明确PCSK9抑制剂对心血管事件的影响，并为新一代降脂药物的研发提供充足的理论依据[32-34]。

此外，最新研究表明，inclisiran（ALN-PCSsc）是一种长效的、RNA干扰（RNAi）方式抑制PCSK9合成进而降低人体的LDL-C水平的制剂。Ⅰ期试验中，将LDL-L水平不低于100mg/dl的健康志愿者，按比例3∶1随机分配至两组。两组参与者分别接受inclisiran或安慰剂皮下注射：剂量组分配至单次给药剂量递增阶段（25、100、300、500或800mg）或多次给药阶段（每周1次125mg，给药4次；隔周1次250 mg，给药2次；或每月1次300或500mg，给药2次，联合或不联合他汀类药物治疗）；每个剂量组包括4～8例参与者。结果显示，最常见的不良事件为咳嗽、肌肉骨骼疼痛、鼻咽炎、头痛、背痛和腹泻。所有不良事件均为轻或中度。未观察到严重不良事件发生。给药剂量达到300mg或更高（单次或多次给药）时，inclisiran可显著降低PCSK9和LDL-L至少6个月。inclisiran研究是小型Ⅰ期试验，其长期安全性及有效性有待于进一步研究[35]。

3 PCSK9/NARC-1与神经系统疾病

随着研究的深入，发现PCSK9就是与胆固醇代谢相关并与神经细胞分化和凋亡相关的基因。PCSK9基因产物最初发现于神经细胞，损伤引起神经细胞凋亡时该蛋白表达增多。目前研究发现，PCSK9在胚胎发育中有促进神经细胞分化的作用，而体外细胞实验证明PCSK9可促进神经细胞的凋亡。Bingham等[36]研究发现NARC-1mRNA在小脑颗粒神经元（CGNs）的表达发生在凋亡损伤后,而凋亡调节因子（caspase-3和死亡受体6）的共同调节增加了NARC-1参与神经元凋亡信号传递的可能性。用野生型和突变型NARC-1/EGFP融合载体转染CGNs，然后计算在转染子中细胞死亡的数量，发现野生型NARC-1有着强大的促凋亡效应。而NARC-1/EGFP过表达从而诱导细胞死亡的机制仍然不清楚[37]。

PCSK9不仅仅与神经细胞凋亡有关，还与神经细胞分化密切相关。Seidah等[6]取胚胎13.5d的端脑细胞培养，转染PCSK9可增加未分化干细胞向神经细胞分化，认为PCSK9参与大脑皮层细胞分化。Poirier等[38]分别建立小鼠胚胎癌细胞系细胞P19和斑马鱼模型,研究蛋白水解酶对中枢神经系统 (CNS)分化的潜在作用。发现NARC-1/PCSK 9的mRNA水平在分化的第2天达到峰值,随后出现下降,但是并没有影响内源性LDLR的蛋白水平。进一步比较出生1天的小鼠中NARC-1/PCSK9和LDLRmRNA的表达,发现NARC-1/PCSK9除了在肝脏和小肠等组织表达还在小脑神经元有表达,而LDLR却不显著。因此提示NARC-1/PCSK9在神经系统中可能促进其它受体在小脑和端脑发育过程中某些蛋白的降解[11,38]。这些研究揭示了PCSK9除了在肝脏中的作用外在中枢神经系统分化中又有新的作用,而NARC-1/ PCSK9对不同物种如哺乳动物和鱼类,神经系统的作用是不同的,具体机制还有待研究。神经系统退行性病变是危害老年人健康和影响老年人生活质量的一类疾病，如帕金森病和阿尔兹海默病。促进神经细胞分化，抑制其凋亡是防治神经系统退行性疾病的重要环节。如何利用PCSK9的这种双面性作用以更好地防治神经系统退行性病变有待于进一步研究。

4 PCSK9与肿瘤

研究发现PCSK9过表达可引起细胞的凋亡、炎症及应激反应等多条通路失调。肿瘤的发生、发展涉及到细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物效应，因此推断PCSK9在肿瘤的发生、发展中起到一定的作用[16,39-40]。Demidyuk等[41]利用qRT-PCR检测PCs家族在30例病理分型尚不明确的肺癌组织及正常癌旁肺组织的mRNA，发现PCSK9在29例正常组织中均表达，而只在18例肺癌组织中表达。分析PCSK9在肿瘤和正常组织之间mRNA水平有统计学差异（P＜0.05）。由此可见，PCSK9在肺癌中呈低表达，而其在肺癌中的具体作用机制尚不明确。Lan等[39]证实PCSK9诱导胆固醇合成基因上调从而导致体内胆固醇减少，此外还发现PCSK9在肝癌Hep G2细胞内除影响胆固醇代谢还可作用其他基因表达通路，而这些通路与胆固醇的代谢是无关，包括蛋白质泛素化、异物质新陈代谢、细胞周期、炎症及应激反应。这些细胞的基因表达通路与肿瘤的发生、发展有一定关系，可见PCSK9在多种肿瘤表达及与肿瘤发生、发展的多种细胞生物学过程有关。研究发现，PCSK9可影响核因子B（NF-κB）途径、p53、转录因子3、肿瘤坏死因子超家族成员4基因相关通路[41]。NF-κB是一种转录因子，异常激活的NF-κB与细胞炎症、恶性肿瘤生长、恶性转化、肿瘤侵袭转移有关[42]。TNF-α水平在胃癌明显增高，其增高程度与临床分期有关[43]，而PCSK9与p62、NF-ΚB及TNF-α均有联系，这些通路与PCSK9蛋白在胃癌的病理分化程度及淋巴结转移中有着密切关系。因此，PCSK9可能与胃癌发生及淋巴结转移有关，但具体机制有待于进一步研究。因此，PCSK9可作为新的筛选指标及预后指标，并为靶向药物的研究提供新的思路。

5 PCSK9与其他

PCSK9参与多种疾病的发生、发展。Burkart等[44]研究表明，PCSK9可通过增加胆固醇水平，进而促进慢性阻塞性肺炎的发生，因而PCSK9对慢性阻塞性肺炎具有潜在的诊断价值。此外，Persson等[45]研究发现，在大鼠中高水平的内源性雌激素可降低血浆PCSK9水平，表明内源性雌激素可增加肝细胞表面LDLR数量。这在一定程度上可以解释绝经前后妇女的血脂改变[46]。不久的将来，PCSK9的更多功能将被揭晓。

6 小结与展望

综上所述，已经明确PCSK9通过降解LDLR从而在胆固醇代谢中发挥重要作用。同时PCSK9抑制剂如单克隆抗体、RNA干扰的基础和临床研究均显示出令人欣喜的进展，有望成为新的革命性降脂药物，为高胆固醇血症的联合治疗开辟新的途径。PCSK9在帕金森病、肝癌、慢性阻塞性肺炎等疾病的发生、发展中能否起着重要作用，能否作为这些疾病早期诊断的分子标志，以及能否作为肝癌等肿瘤靶向治疗的有效靶标，这些都是我们任重而道远的研究任务。因而，深入研究PCSK9在神经系统疾病、肿瘤、呼吸系统疾病中的功能并分析其具体的分子机制，将为探索PCSK9调控人类疾病的研究奠定基础，为临床靶向治疗疾病提供新的靶点。

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（本文编辑：沈昱平）

中国科协印发科技工作者自律规范：坚持四个“自觉”坚守四条“底线”

为弘扬科学精神，中国科学技术协会2017年7月13日印发《科技工作者道德行为自律规范》。近年来，我国科技发展取得举世瞩目的成就，也暴露出一些问题。2015年以来，我国科技界接连遭遇国外出版集团较大规模的集中撤稿，造成恶劣社会影响，国际声誉受到直接冲击。撤稿事件反映出我国少数科技工作者缺乏自律意识，底线意识不强，在名利诱惑面前心态失衡。

自律规范要求广大科技工作者严于自律，坚持自觉担当科技报国使命、自觉恪尽创新争先职责、自觉履行造福人民义务、自觉遵守科学道德规范，坚守反对科研数据成果造假、反对抄袭剽窃科研成果、反对委托代写代发论文、反对庸俗化学术评价等四条“底线”，肩负起推动创新驱动发展、建设世界科技强国的历史重任。

自律规范明确反对委托代写代发论文。要求科技工作者遵循论文撰写和发表规范。反对以粗制滥造和低水平重复论文挤占浪费学术资源，共同抵制学术论文发表中第三方中介机构投机取巧谋取利益的不端行为，反对委托“第三方”代写代投论文、对论文内容进行实质性修改、提供虚假同行评审人信息或评审意见，维护好中国科技工作者的社会形象和学术尊严，提升中国科学家的国际声誉。

自律规范明确反对压制学术民主和学术自由，反对滥用学术权力徇私舞弊利益寻租，反对学术评价中唯论文数量、唯S CI等不良倾向，反对行政化官本位等非学术因素影响评价，反对拉关系送人情，暗箱操作，亵渎学术尊严。

中国科协要求各全国学会、地方科协和高校科协、企业科协组织科技工作者深入学习自律规范，加强自律监督；进一步改革完善科技评价体系，为科技工作者创新创业提供良好的政策和环境保障；积极指导推动高校、科研院所、医院等建立学术道德委员会等内设机构，健全科研诚信制度规范，加大学术不端行为调查处理力度。

2017-02-06）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2017-215

浙江省自然科学基金(L Y13H 020009)

315211 宁波大学医学院（陈丽）；宁波大学医学院附属李惠利医院心血管内科（廉姜芳、周建庆）

周建庆，E-mail：zh o u jian q in g8701@163.com