干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化研究

盛建国张传森章建全

干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化研究

盛建国1张传森2章建全1

我国目前有超过2亿的甲状腺疾病患者，其中一部分患者经历外科或者放射治疗后可引起甲减，只能通过终身服用合成甲状腺激素进行替代治疗。随着多能干细胞分化研究的深入，已有多种方法将多能干细胞诱导分化为甲状腺滤泡细胞，利用多能干细胞产生甲状腺滤泡细胞，为临床移植治疗甲状腺功能减退症提供新的思路。本文总结近年来诱导多能干细胞分化为甲状腺滤泡细胞的研究进展，并在此基础上对分化细胞的鉴定、安全性及临床应用面临的问题等进行讨论。

甲状腺； 胚胎干细胞； 多能干细胞； 间质干细胞； 细胞分化

甲状腺是人体最重要的内分泌器官之一，它通过合成和分泌甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3），调节人体多种生物活动，例如：新陈代谢、骨骼生长、脑发育、体温调节等，影响着人体内几乎每个组织和细胞。甲状腺疾病相当普遍，我国目前有2亿以上的人患有甲状腺疾病。其中一部分患者经过外科或放射治疗后可能导致甲状腺功能减退，依靠服用人工合成甲状腺素进行替代治疗，部分患者存在长期服药后出现神经认知功能、心理适应性下降，甚至焦虑和抑郁。

多年来，研究人员一直在探索利用干细胞技术治疗甲状腺疾病[1-6]。通过干细胞技术不仅可以修复、替代人体缺损的甲状腺滤泡细胞，还可以避免对合成甲状腺激素的依赖。这种基于干细胞技术的再生医学的核心是多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）。PSC是一种特殊的干细胞群，有3个主要特点：（1）自我更新；（2）自我增殖；（3）向三个胚层多向分化的能力。PSC根据细胞来源不同可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）及间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）。本文将对上述三类干细胞向甲状腺滤泡细胞（thyroid follicular cell，TFC）分化的实验研究进行综述。

一、甲状腺细胞的组织来源及关键发育调控基因

对于目的细胞的组织来源与基因调控的深入研究是干细胞定向分化成功与否的基础。甲状腺由两种内分泌细胞组成：TFC和滤泡旁细胞（calcitonin cell，C细胞）。大部分腺体组织由TFC构成，它来源自前肠内胚层，是体内负责合成与分泌甲状腺激素的场所。在胚胎发育的原肠胚期，定型内胚层（de fi nitive endoderm，DE）衍生的原始肠的前肠内胚层前后轴被分布到包括原始甲状腺、肺、胰腺和肝脏等器官的特异性结构域中[7-8]，这些器官结构域的局部特异性的主要标志是前后轴上不同位置的表达的特异转录因子[8]。2001年Damante等[9]在胚胎早中期的原始咽中发现了一小组细胞可以发育成TFC，并且通过Nkx2-1、Foxe1、Pax8和Hhex四种基因的共表达对这组细胞进行分离提纯。这些基因虽然可以在甲状腺外组织中单独表达，但是他们只在甲状腺内共同表达。他们通过建立甲状腺特异性基因表达程序来指导甲状腺的器官发育[9]。

上述四种基因的作用目前已经基本研究明确，Nkx2-1和Pax8主要负责驱动Tg、TPO和NIS基因的甲状腺特异性激活[10-11]，在维持甲状腺滤泡细胞存活、甲状腺滤泡结构的维持及甲状腺发育后期维持甲状腺前体细胞的存活方面发挥作用[12-13]。Foxe1的主要作用是调控甲状腺前体细胞迁移的作用[14]。Hhex主要作用包括间接调控甲状腺原基的形成、发育后期甲状腺前体细胞的存活、甲状腺前体细胞迁移等[15-17]。

二、胚胎干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化

ESC起源于胚泡期胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）[18-20]。当去除了维持多能性的培养条件后，ESC将可分化产生胚胎内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的细胞[21]。所以，评估ESC的分化潜能对于其在未来研究和治疗应用中的有效性至关重要。Keller等[21]和Doetschman等[22]研究发现可以将完全或部分分离的ESC在非附着条件下集簇形成球形集落即类胚体（embryoidbodies，EBs）进行体外分化，EBs细胞可以在附着底物后长时间培养和分化。这一特性配合新的合适的培养条件和方案，为ESC向TFC的分化研究提供了研究基础。

2001年Espinoza等[23]研究发现Pax8和Nkx2-1在甲状腺Tg基因启动子的表达中起主要作用。Lin等[1]在2003年通过在培养的EB中表达甲状腺谱系标志物的方法首次证明了鼠胚胎干细胞可以体外分化成TFC，同时表明了在无血清条件下，EB分化的单层细胞中持续的Pax8和TSHr基因表达需要TSH，而Tg没有表达。Arufe等[2,6]利用基因编辑方法将绿色荧光蛋白标记于TSH受体启动子基因，用来示踪内源性TSHR，这些ESC经过胰岛素和胰岛素样生长因子-1刺激后，在含有TSH的基底膜基质中分化出具有滤泡样结构的TFC簇。为了更有效的在体外向TFC定向分化，细胞需要进行有条件地引导培养，从而有利于DE形成，进而分化成甲状腺祖细胞发生部位——前肠内胚层前部（anterior foregut endoderm，AFE）。Kubo等[24]通过对非洲爪蟾的发育研究发现：（1）FBS虽然是中胚层来源细胞系分化的有效诱导剂，但对内胚层诱导效果差；（2）限制mESC暴露于血清可以增强DE相关基因的表达；（3）含有激活素的培养基可以有效增加小鼠和人ESC中DE的数量。但是，仅由激活素诱导产生的DE对甲状腺细胞系产生抵抗，需要额外的修饰培养。Green等[25]在成形素与抑制素推动DE向AFE转变的研究实验中发现NOGGIN（BMP信号拮抗剂）和SB-431542（激活素A/nodal和TGF-β信号传导的药理学抑制剂）协同由WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF组成的生长因子混合物可以进一步将人类胚胎干细胞导向腹侧AFE。然而，Longmire等[26]发现这种加入FGF2的鸡尾酒方法是有效诱导mESC中Nkx2-1所必须的。这些发现表明通过阶段特异性和时间依赖性BMP/TGF-β抑制，然后组合诱导BMP和FGF信号，可以有效地在内胚层祖细胞中产生甲状腺感受态细胞（由Nkx2-1，Foxa2和Pax8表达证明）。

Antonica等[4]和Ma等[5,27]通过激活关键转录因子Pax8和Nkx2-1有效地将鼠和人类ESC分化为功能性TFC，由此衍生的TFC通过表达特定的转录因子能够形成三维的具有功能性甲状腺滤泡。虽然将Pax8和Nkx2-1转染到ESC中以启动分化过程的初始方法也可以诱导表观遗传改变，但却在体内移植后发现肿瘤形成。但对甲状腺分化过程中多种生长调节因子的甄别却可以作为甲状腺细胞分化的非转染方法考虑[28]。使用这些基因的关键转录调节子已经探索了诱导PAX8和NKX2-1的不同方法。Ma等[29]通过Pax8和Nkx2-1的转录共激活因子TAZ将hESC诱导分化成TFC，观察到甲状腺滤泡形成、丰富的TG蛋白表达、TSH诱导和剂量依赖性放射性碘摄取及蛋白结合碘的积累，但TAZ在其中的作用机制目前并没有得到全部清楚表述，有待后续研究。

最终，到目前为止，TFC的定向分化只有在mESC中证实，尚不能确定目前的机制和方法是否同样对hESC有同样的研究结果。

三、诱导多能干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化

Takahashi等[30]在2006年通过简单的强制表达四个转录因子（Oct4，Sox2，Klf4和 c-Myc；统称为 OSKM或Yamanaka因子），成功的将成纤维细胞转换为PSC。Yamanaka因子是通过沉默体细胞和逆转录病毒基因、激活多能性基因网络、诱导表观遗传改变这三个步骤来对体细胞进行重编程。开辟了个性化的再生医学领域。iPSC技术跨越了技术和伦理障碍，作为个体化细胞替代疗法的无限来源具有巨大的希望。

iPSC技术经历了大量关键因素的改进和发展，已经使得iPSC可以用于治疗目的。Wernig等[31]和Tsuji等[32]成功利用源自小鼠iPSC的神经细胞治疗实验小鼠模型中的帕金森病和脊髓损伤，疗效也是安全的。Kobayashi等[33]研究发现人类iPSC衍生的神经干细胞和祖细胞可以安全有效的治疗非人类的灵长类动物的脊髓损伤。但iPSC向TFC的诱导分化研究甚少。

Ma等[34]于2015年通过使用EF1a-STEMCCA多顺反子（OKSM）慢病毒感染的小鼠胚胎成纤维细胞生成小鼠iPSC细胞，随后通过载体转染Pax8-1和Nkx2-1基因，在激活素A和TSH作用下生成TFC，结果显示iPS细胞中甲状腺特异性基因NIS，TSHR，Tg和TPO的表达显着增强，功能性甲状腺滤泡细胞具有剂量依赖性cAMP产生和放射性碘吸收。此外，细胞在培养物中形成三维滤泡结构，并且在PAX8+NKX2-1+iPS细胞移植到裸鼠中后形成“甲状腺样器官”，并且根据免疫组织化学判断所有细胞都表达Tg蛋白。这一分化的TFC的性质与先前ESC细胞分化的TFC非常相似。这一研究结果也证明iPSC可以给干细胞向TFC的分化研究提供一种全新的种子细胞。

四、间充质干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化

目前MSC向TFC分化的研究主要集中在骨髓间充质干细胞和脐带血间充质干细胞。上述两项研究均为国内研究者的初步尝试和探索，不如国外ESC细胞研究那样深入，水平有待加强，。

（一）BMSC向甲状腺滤泡细胞的分化

刘东源团队于2011年研究显示，利用第3代人骨髓间充质干细胞在胰岛素和TSH的诱导分化下，通过流式细胞检测结果显示可见TSHr（99%）和Nkx2-1（99%）表达[35]。同年，刘东源领导的另一组研究人员通过使用SD大鼠的BMSC利用相同的诱导条件，得出如上相同的结果[36]。虽然两组人员初步探讨了体外诱导BMSC源性甲状腺细胞的方法及可行性，取得了TSHR及Nkx2-1的高表达，但并未对诱导后细胞做细胞免疫荧光分析及RT-PCR分析，也未对诱导后细胞做功能测定。

潘倩等[37]2015年利用Transwells小室构建了大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠甲状腺细胞FRTL-5共培养体系，利用TSH、胰岛素、转铁蛋白、生长抑素及氢化可的松作为诱导分化培养基诱导分化大鼠BMSC。结果显示细胞免疫组化检测到Pax8和Nkx2-1的显著表达，细胞免疫荧光法也检测到NIS、TPO和Tg的显著表达。RT-PCR检测Pax8和Nkx2-1基因含量增加。细胞功能方面试图利用电化学发光法检测T3和T4的含量，但因诱导分化培养基中添加了胎牛血清，后者包含T3、T4激素类物质，尽管检测结果的排他性不强，但与其他各组检测结果相比较，结果具有明显差异，较其他组增高趋势明显，与其他3个检测结果综合起来分析，总体研究结果仍然是有借鉴价值的。

（二）UCMSC向甲状腺滤泡细胞分化

李振想等[38]利用TSH、胰岛素及干细胞生长因子在体外诱导人脐带血间充质干细胞向TFC分化，流式细胞结果显示Nkx2-1和TSHR的表达率分别为27.2%和65.7%，但蛋白质分子层面和基因表达水平均未作检测。

五、干细胞治疗中的关键问题

ESC不仅在伦理上具有明确的争议，还存在分化组织移植后的免疫排斥问题[30]。与ESC不同，iPSC没有伦理争议问题，能够从大量学术和商业实验室中获得，可以用于创伤治疗中移植供体的来源和广泛的疾病治疗中。但无论哪种诱导方式或者重编程方式如何，在干细胞用于人体疾病治疗前，必须知晓所有潜在的可引起疾病的基因改变，这显然存在较大难度和挑战。

在实现PSC在细胞替代治疗中的实际应用之前，需要解决许多问题[39]，以下论点可能不够详尽：（1）建立无异种的和化学组分确定的培养条件以降低培养中的变异并根除潜在引入的可能引发免疫应答的异种抗原；（2）制定特定谱系的有效诱导方案；（3）确定细胞的成熟阶段和所需的治疗细胞剂量；（4）制定谱系选择和（或）清除未分化细胞以减少移植物的PSC污染的严格策略；（5）解决导致GvHD的供体（受体）相容性；（6）iPSC和ESC之间公认的差异，如表观遗传学（异常表观遗传记忆以及供体细胞记忆）和突变负荷是否产生不同的治疗结果；（7）对于治疗成功与否至关重要的就是能够开发出将治疗细胞转运到靶位置的投放技术。

六、结论

利用PSC来源的TFC治疗甲状腺功能减退症，将有效解决临床移植供体材料的来源难题，要看到干细胞研究和谱系定向培养技术的快速发展，特别是TFC的诱导分化研究取得的巨大进展，更要清醒地认识到在临床应用前的道路上仍有上述许多问题需要解决。相信基于干细胞技术的再生医学用于治疗甲状腺疾病只是时间问题。

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Generation of thyroid follicular cells from stem cells

Sheng Jianguo1, Zhang Chuansen2, Zhang Jianquan1.
1Department of Ultrasound in Medicine, ChangzhengHospital, Shanghai 200003, China;2Research Center of Regenerative Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China

ZhangJianquan, Email:ultramez@sina.com; ZhangChuansen, Email:chuansenzhang@126.com

More than 200 milllion people in China are afflicted with a thyroid related disorder. The majority of patients may cause hypothyroidism after surgery or radiation therapy. The synthetic thyroid hormone is the replacement therapy for hypothyroidism. Due to the great progresses in the research of pluripotent stem cell differentiation, thyroid follicular cells derived from pluripotent stem cells may become a solution to this issue. In this review, we summarize recent advances in the enrichment and purification of differentiated cells, and discuss the concerns of tumorigenicity,immunological rejection and clinical uses.

Thyroid gland; Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Messenchymal stem cells; Cell differentiation

2017-02-15）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.012

国家自然科学基金（81171436）

200003 上海，第二军医大学附属长征医院超声诊疗科1；200433 上海，第二军医大学再生医学研究中心2

章建全，Email：ultramez@sina.com；张传森，Email：chuansenzhang@126.com

盛建国，张传森，章建全.干细胞向甲状腺滤泡细胞的分化研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志（电子版），2017，7（3）：185-188.