海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究❋

贺 惠，张 玉，甄 毓❋❋，米铁柱，陈阳阳，于志刚(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛266003；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛266100；3.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛266100；4.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛266071；5.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛266100)

海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究❋

贺 惠1,3,4，张 玉2,3,4，甄 毓2,3,4❋❋，米铁柱2,3,4，陈阳阳2,3,4，于志刚4,5
(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛266003；2.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛266100；3.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛266100；4.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛266071；5.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，山东 青岛266100)

沉积物成分复杂，腐殖酸等物质含量较高，这些杂质在DNA提取过程中不易除去，可能会对后续的PCR扩增等产生抑制作用。因此，高质量DNA的获得是海洋微生物分子生态学研究的基础和前提。本研究采用6种不同的方法，分别提取同一来源海洋沉积物样品中的微生物基因组DNA。对DNA纯度、得率、16S rRNA基因拷贝数和微生物群落特征等多方面进行比较，结果表明：方法1(QIAamp DNA Stool Mini Kit)、方法2(PowerSoil®DNA Isolation Kit)和方法3(RNA PowerSoil®DNA Elution Accessory Kit)得到的DNA产量较低，纯度却较高，可以直接用于后续分子生物学分析；与方法2相比，方法3得到的细菌16S rRNA基因拷贝数和单位质量DNA中可扩增细菌16S rRNA基因模板量较低；方法4(SDS高盐法)得到的DNA虽然产量高，但杂质含量也高，抑制了后续PCR反应的进行；方法5(方法4得到的DNA经QIAamp DNA Stool Mini Kit纯化)和方法6(方法4得到的DNA经PowerSoil®DNA Isolation Kit纯化)，虽然纯度有所提高，但DNA大量损失，且耗时长，花费高。另外，方法2在提取过程中可以最大程度裂解菌体细胞壁，能更好反映微生物群落特征。综合以上结果，方法2(PowerSoil®DNA Isolation Kit)提取海洋沉积物微生物基因组DNA效果最佳。本研究可为海洋微生物分子生态学研究提供一种有效的技术手段。

沉积物；微生物；DNA提取

1980年代以前，海洋微生物多样性研究一直以分离培养的方法为主，即将海洋微生物从环境中分离纯化后，根据微生物的形态和生化特征等进行多样性分析。然而，由于方法的限制，海洋中的微生物大多数不能培养，仅有少数海洋细菌(0.01%～0.1%)可形成菌落被培养出来[1]。1986年Pace等首次将核酸测序技术应用于微生物学分析后，聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)、分子杂交及克隆文库等多种分子生物学技术得到了越来越广泛的应用[2-4]。分子生物学技术的应用克服了传统培养方法难以分离培养出所有微生物的缺点，成为微生物生态学研究的重要手段。

沉积物中成分复杂，腐殖酸、酚类物质、重金属等含量较高，这些杂质在DNA提取过程中不易除去，可能会对后续的PCR扩增等产生抑制作用。因此，高质量DNA的获得是微生物分子生态学研究的基础。对海洋沉积物样品来说，十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, sodium salt, SDS)高盐提取[5-6]和试剂盒提取是两类常用沉积物DNA提取方法。本研究采用SDS高盐提取法和几个试剂盒等共6种方法对同一海洋沉积物样品进行DNA提取，通过DNA纯度、DNA得率、16S rRNA基因拷贝数及微生物群落结构等方面的比较，找出一种高效的针对海洋沉积物中微生物基因组DNA的提取方法，为海洋微生物分子生态学研究提供一种有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

2014年5月采集山东半岛乳山湾邻近海域表层沉积物，采样站位为C2站(121.49°E，36.66°N)和C5站(121.51°E，36.50°N)(见图1)。将沉积物分装于灭菌铝盒中，置于-80°C超低温冰箱中进行保存。

1.2 海洋沉积物中微生物基因组DNA的提取

采用6种方法分别提取同一海洋沉积物样品，每个样品重复提取3次。6种DNA提取方法分别对应方法1(M1)、方法2(M2)、方法3(M3)、方法4(M4)、方法5(M5)及方法6(M6)。

1.2.1 方法1 沉积物自然解冻后，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)提取沉积物微生物基因组DNA，溶于200 μL缓冲液，-20 °C保存。实验根据试剂盒的说明书进行操作。

1.2.2 方法2 沉积物自然解冻后，用PowerSoil®DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)提取沉积物微生物基因组DNA，溶于100 μL缓冲液，-20 °C保存。实验根据试剂盒的说明书进行操作。

1.2.3 方法3 沉积物自然解冻后，用RNA PowerSoil®DNA Elution Accessory Kit(MOBIO, USA)提取沉积物微生物基因组DNA，溶于100 μL缓冲液，-20 °C保存。实验根据试剂盒的说明书进行操作。

1.2.4 方法4 沉积物自然解冻后，用SDS高盐法提取沉积物中的DNA[5-7]。称取5 g样品，与13.5 mL DNA提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1磷酸钠，1.5 mol·L-1NaCl，1% CTAB，pH=8.0)混合，加入100 μL蛋白酶K(10 mg·mL-1)，于225 r·min-1摇床上37 ℃振荡30 min。加入1.5 mL 20% SDS，65 ℃水浴2 h，每隔15 min轻轻颠倒几次。加入2% PVPP，室温6 000 g离心10 min后，将上清液转移到50 mL离心管中。在沉淀中再加入4.5 mL DNA提取液和0.5 mL 20% SDS，涡旋10 s，65 °C水浴10 min，室温6 000 g离心10 min，重复抽提2次，将3次抽提得到的上清液转移到同一离心管中。加入RNaseA(终浓度为200 μg·mL-1)，37 °C下作用15 min后，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(体积比为24∶1)混合，6 000g离心10 min后，将上清液转移至另一50 mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1 h后16 000g离心20 min，收集沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀两次，加入500 μL灭菌的去离子水重悬沉淀，-20 °C保存。

1.2.5 方法5 将方法4得到的DNA经QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)纯化，溶于200 μL缓冲液，-20 ℃保存。

1.2.6 方法6 将方法4得到的DNA经PowerSoil®DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)纯化，溶于100 μL缓冲液，-20 ℃保存。

1.3 DNA得率与纯度检测

采用超微量紫外分光光度计(Picodrop, UK)测定各种提取方法得到的DNA浓度和OD260/OD280等。根据测得的浓度计算每克沉积物中DNA的提取量，作为DNA得率的指标。

1.4 细菌16S rRNA基因拷贝数检测

1.4.1 质粒标准品的制备 使用V3-V4可变区的扩增引物338F: 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和806R: 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’[8-9]扩增细菌16S rRNA基因，退火温度为58 ℃，扩增产物长度约为470 bp。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，纯化目的片段。将纯化产物连接到pMD18-T载体上后进行转化反应，选取阳性克隆提取质粒。快速质粒小提试剂盒(康为，北京)制备质粒，将得到的质粒DNA进行PCR扩增，经电泳确认后，送测序公司(华大基因，北京)测序。用超微量紫外分光光度计测得重组质粒的浓度，计算重组质粒的拷贝浓度。将得到的质粒10倍梯度稀释，保存在-80℃超低温冰箱中，用于建立定量PCR体系的质粒标准曲线。1.4.2 标准曲线的建立与样品测定 以梯度稀释的质粒标准品为模板，利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche, Germany)进行qPCR(Applied Biosystems, USA)，并在反应体系中加入0.2 μg·μL-1牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)[10]。退火温度为58 ℃。扩增完毕后进行熔解曲线分析，保证每个样品都是特异性扩增。每个质粒浓度3个平行样，实验体系中同时添加阴性对照。以质粒拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定的qPCR体系和条件与标准曲线相同，每个样品设置3个平行样，实验体系中同时添加阴性对照和阳性对照。根据标准曲线换算样品中细菌16S rRNA基因拷贝数。同时，我们引入“可扩增浓度”表征单位质量DNA中可扩增细菌16S rRNA基因模板量。1.5 细菌群落结构、多样性分析

1.5.1 Illumina高通量测序 选取方法1、2、3提取的C2站DNA为模板，选择16S rRNA基因V3-V4区作为测序区域，使用带有测序标签barcode的特异引物338F/806R进行PCR扩增。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，根据产物浓度进行等量混样后，纯化目的条带。采用试剂盒进行扩增子文库构建，检测合格后，使用Miseq测序平台进行上机测序，高通量测序委托上海锐翌生物科技有限公司进行。将测序得到的16S rRNA基因核酸序列上传至NCBI高通量测序数据库Sequence Read Archive(SRA)，登录号为SRP073067。

1.5.2 原始数据拼接及序列质量控制 使用FLASh(Fast Length Adjustment of Short reads)软件利用重叠区域将双末端测序得到的成对reads拼接成一条序列，并对其测序质量进行筛选，删除引物或barcode错配碱基数大于1的序列、碱基质量分数较低的序列和长度较低的序列等，得到高质量序列，用于进行后续的生物信息学分析。

1.5.3 OTU聚类 使用Uparse在0.97相似性水平下对16S rRNA基因序列进行聚类，得到用于物种分类的操作分类单元(Operational taxonomic unit, OTU)。与GreenGenes数据库比对后，对每个OTU进行物种注释，并分析物种的相对丰度。

1.5.4 生物信息学分析 利用Qiime软件计算Alpha多样性指数，包括物种丰富度指数(Chao I、ACE)、香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)等，并进行稀释曲线分析，评估不同方法得到的DNA中微生物群落的物种丰富度和多样性。

2 结果与分析

2.1 DNA纯度比较

OD260/OD280是检测DNA纯度的常用指标，主要用来检测DNA的纯度。一般认为，提取的DNA越纯，OD260/OD280应该越接近1.8。由图2可知，方法4和方法5得到的DNA OD260/OD280比值低于1.6，说明DNA纯度不高，存在蛋白质或酚类污染。相比较而言，其余4种方法得到的DNA OD260/OD280比值均超过1.6，说明这4种方法所得的DNA杂质去除效果较好，纯度较高。

从提取的DNA颜色也可以判断其中腐殖酸的含量，方法4所得的DNA颜色为浅褐色，说明其中含有大量的腐殖酸，污染最严重。

2.2 DNA得率比较

由图3可知，方法1、方法5和方法6得到的DNA含量较低，每克沉积物中DNA含量均低于5 μg，而方法2、方法3和方法4得到的DNA含量较高。对于方法4，虽然DNA得率为19 μg·g-1，但因杂质含量较高，根据OD260计算得到的DNA含量可能与实际的DNA含量不符。

2.3 16S rRNA基因拷贝数比较

2.3.1 细菌16S rRNA基因质粒标准曲线 以质粒拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线(见图4)。回归方程为y=-3.585x+41.647，回归系数r=-0.999。熔解曲线只在83.5 ℃处有一单峰出现，说明qPCR反应过程中无引物二聚体或其他非特异性扩增。

2.3.2 细菌16S rRNA基因拷贝数比较 利用qPCR对不同方法提取的DNA进行16S rRNA基因拷贝数定量，发现不同提取方法得到的DNA中拷贝数存在差异(见图5)。方法4得到的DNA中杂质含量较高，抑制了PCR反应的进行，因此无法检测其中16S rRNA基因拷贝数。其余五种方法中，方法2得到的DNA中16S rRNA基因拷贝数最高，与其他方法差异显著(P<0.05)。

2.4 单位质量DNA中可扩增细菌16S rRNA基因模板量比较

由于提取方法不同，DNA中杂质含量存在差异，对于PCR扩增的抑制程度不同，因此对于同一样品的同一个目的基因，扩增得到的拷贝数可能不同。从图6可知，对于C2或C5站，可扩增浓度都是方法2、1和6较高，其中方法2的可扩增浓度最高，与其他方法差异显著(P<0.01)。

2.5 细菌群落结构比较

由于方法4得到的DNA需进一步纯化才可用于下游实验，方法5、6得到的DNA虽然纯度有所提高，但损失较大，且花费较高，因此选择方法1、方法2、方法3得到的C2站DNA为模板进行细菌群落结构分析。

2.5.1 序列统计、细菌多样性及丰富度指数统计 对方法1、2、3得到的C2站沉积物微生物基因组DNA进行测序，共得到133 332条序列(见表1)，3种方法得到的序列条数介于42 361～47 343之间。按照0.97的序列相似性进行OTU聚类，共得到2 904个OTUs，3种方法得到的OTU个数介于1 824～2 203之间。

M1、M2和M3的覆盖度(Coverage)均高于99%，且随着序列数的增加，稀释曲线趋于平稳(见图7)，说明再增加测序量也只能产生少量的OTUs，现有的测序深度足以反映样品中绝大多数微生物信息。由表1可知，方法2与方法3得到的DNA中细菌丰富度比方法1高；Shannon指数则说明方法3得到的DNA中细菌群落多样性较高。

2.5.2 细菌群落组成比较 由于不同的DNA提取方法偏好性不同，因此得到的细菌类群有所差异。将方法1、2、3得到的16S rRNA基因序列与GreenGenes数据库比对，3种方法检测到的能确定分类地位的细菌类群见表2。由表2可知，方法2、3得到的细菌类群范围更广泛。

分析3种方法得到的细菌类群发现，变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteriodetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、WS3等均是丰度较高的类群，其中变形菌门是所有类群中丰度最高的菌群(见图8)。

对于变形菌门，在纲分类水平上，Gamma-变形菌纲、Delta-变形菌纲、Alpha-变形菌纲、Beta-变形菌纲、Epsilon-变形菌纲在3种提取方法所得的序列中均有分布(见图9)。其中，Gamma-变形菌纲占据绝对优势地位(在M1、M2和M3中所占比例分别为45.71%、61.67%、53.89%)，其次是Delta-变形菌纲(在M1、M2和M3中所占比例分别为27.10%、27.96%、35.71%)；而对于Zeta-变形菌纲，只出现在方法2、3得到的序列中，且丰度最低(在M2和M3中所占比例分别是0.09%和0.004%)。

3 讨论

目前，微生物多样性研究通常采用分子生物学手段，如克隆文库技术、高通量测序技术和qPCR技术等，然而这些技术的前提是获得片段完整、纯度较高且能全面覆盖微生物信息的DNA，因此微生物基因组DNA的提取尤为重要。对海洋沉积物样品而言，常用的DNA提取方法有试剂盒提取和SDS高盐提取2类。

本研究中使用的方法4即为SDS高盐法。通过研究发现，方法4步骤繁琐，耗时较长，且得到的DNA溶液为浅褐色，表明其中腐殖酸等杂质残留较多，可能会抑制后续PCR过程中DNA聚合酶的活性[11-12]。虽然提取过程中添加了能够吸附腐殖酸等杂质的交联聚乙烯吡咯烷酮(Crosslinking polyvingypyrrolidone, PVPP)，但qPCR过程仍受到抑制，无法检测到PCR产物。对方法4得到的粗提DNA，分别采用方法1、2的试剂盒进行纯化，即本研究中的方法56，虽然得到的DNA纯度有所提高，但纯化过程会造成DNA的大量损失，DNA含量下降约10倍，表明纯化过程会导致DNA的大量损失[13]。且耗时长、花费高，可能会导致微生物群落结构和多样性的分析结果出现偏差[14-15]。

相比之下，试剂盒法(方法1、2、3)在DNA提取过程中加入了去除腐殖酸等杂质的步骤，虽然DNA产量较低，但纯度较高，可以直接用于后续分子生物学分析。

目前qPCR技术是研究微生物群落丰度的主要手段。本研究以细菌16S rRNA基因为目的基因，对于同一海洋沉积物样品来说，方法1、2、3得到的16S rRNA基因拷贝数较高，其中方法2得到的16S rRNA基因拷贝数最高。由于提取方法不同，DNA中可抑制PCR扩增的杂质含量存在差异，因此对于同一样品的同一个目的基因，扩增得到的拷贝数可能不同。本研究中，我们引入“可扩增浓度”表征单位质量DNA中可扩增16S rRNA基因模板量。对于C2或C5站，可扩增浓度都是方法1、2和6较高，且2个站位都是方法2的可扩增浓度最高。因此，与其他提取方法相比，方法2提取得到的DNA质量较高，对于可抑制PCR扩增的杂质处理得比较完全。

在用Illumina高通量测序技术比较细菌群落结构和多样性时发现，方法2、3能发掘出更多的细菌类群，且其多样性相对较高。提取DNA时，方法2、3都采用裂解液和玻璃珠破碎相结合的方法破碎细菌菌体，对微生物细胞壁的破碎效果较好，因而能更好地反映海洋沉积物微生物的群落结构和多样性情况；而方法1只采用裂解液破碎菌体，可能对微生物细胞壁的破碎不完全，从而导致在分析微生物群落结构和多样性时出现偏差。从微生物多样性和菌群覆盖度的角度考虑，方法2、3较好。但与方法2相比，方法3得到的细菌16S rRNA基因拷贝数和单位质量DNA中可扩增细菌16S rRNA基因模板量较低，因此方法2更能客观地反映样品中微生物群落丰度的真实信息。

4 结语

与其他提取方法相比，方法2得到的DNA纯度高，可抑制PCR扩增的杂质含量较低，有利于后续的分子生态学分析。该方法在提取过程中对菌体细胞壁达到最大程度的裂解，可以更好地反映微生物群落结构和多样性情况。因此，方法2即PowerSoil®DNA Isolation Kit试剂盒提取海洋沉积物微生物基因组DNA效果最佳，适合用于海洋沉积物中微生物分子生态学研究。

致谢：感谢国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心冉祥滨老师及刘军同学在野外采样中给予的帮助。

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责任编辑 高 蓓

Comparison Study on Extraction Methods of Microbial DNA in Marine Sediments

HE Hui1,3,4, ZHANG Yu2,3,4, ZHEN Yu2,3,4, MI Tie-Zhu2,3,4, CHEN Yang-Yang2,3,4, YU Zhi-Gang4,5

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.College of Environmental Science and Engineering, Qingdao 266100, China; 3.Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China; 4.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;5.The Key Laboratory of Marine Chemical Theory and Technology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China)

The composition of sediments is complex, and the impurities, such as humic acid, are difficult to remove when DNA extraction. Because of the inhibition on PCR amplification, high quality DNA is the basis and prerequisite for the molecular ecology of marine microorganisms. In this study, six different methods were used to extract microbial DNA from marine sediments. Comparisons of the purity and yield of microbial DNA, 16S rRNA gene copy numbers and the characteristics of microbial community were used to analyze the quality and quantity of the genomic DNA. The results showed that DNA purity obtained by method 1, method 2 and method 3 were high despite low in yield, which could be directly used in the following microbial ecology analysis. Compared to method 2, the bacterial 16S rRNA gene copy numbers and template amount for bacterial 16S rRNA gene in per nanogramme DNA obtained by method 3 was low. DNA obtained by method 4 was high in yield but low in purity. After purification (method 5 and method 6), DNA samples were high in purity but there were massive losses. Moreover, method 2 could fully break up cells, reflecting the characteristics of microbial community better. Synthesizing the above results, the method 2 (PowerSoil®DNA Isolation Kit) was the best one to marine sediment microbial DNA extraction. This study provides an effective technique for the molecular ecology of marine microorganisms.

sediments; microbe; DNA extraction

国家自然科学基金项目(41521064；41376093)；中国科学院海洋生态与环境科学重点实验室、青岛海洋科学与技术国家实验室海洋生态与环境科学开放课题项目(KLMEES201601)资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China(41521064；41376093)；the Open Fund of Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciencea,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,and Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology(KLMEES201601)

2016-07-04；

2016-10-27

贺 惠(1987-)，女，博士生。E-mail:hehui-07@163.com

❋❋ 通讯作者：E-mail:zhenyu@ouc.edu.cn

Q93-3

A

1672-5174(2017)06-017-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160246

贺惠，张玉，甄毓，等. 海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(6):17-24.

HE Hui, ZHANG Yu, ZHEN Yu, et al. Comparison study on extraction methods of microbial DNA in marine sediments [J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6):17-24.