魏 莱, 邹 立,2❋❋, 杨 阳, 任倩倩, 简慧敏(. 中国海洋大学环境科学与工程学院,山东 青岛 26600; 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛 26600;. 中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 26600)
芦苇和海洋微藻有色溶解有机物的吸收和荧光光谱特征分析❋
魏 莱1, 邹 立1,2❋❋, 杨 阳1, 任倩倩1, 简慧敏3
(1. 中国海洋大学环境科学与工程学院,山东 青岛 266100; 2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛 266100;3. 中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100)
有色溶解有机物(CDOM)是海洋碳循环的重要组成部分,其来源、组成和特性是揭示复杂的河口过程的重要依据。本文选取北方河口地区有机碳的主要贡献者,芦苇和海洋微藻,研究其生产的CDOM的吸收光谱和荧光光谱特征。结果显示,芦苇和海洋微藻CDOM吸光度随波长缩短呈指数增长,Sg值与M值之间呈对数型正相关;采用PARAFAC方法解析CDOM荧光三维谱图(EEMs),共识别出3种荧光组分:类色氨酸、类酪氨酸和类腐殖质。芦苇和海洋微藻新溶出或分泌的类酪氨酸组分,其结构基本相同;细胞破碎裂解产生的类色氨酸组分,其结构存在一定差异;类腐殖质组分来源于芦苇和海洋微藻细胞分泌物质降解或细胞破碎裂解产物。
CDOM; 芦苇; 海洋微藻; 光谱吸收; 荧光特性
有色溶解有机物(Chromophoric Dissolved Organic Matter, CDOM)是溶解有机物(Dissolved Organic Matter,DOM)中在紫外和可见光区有着强烈的光吸收特性的部分,是DOM的重要组成部分,由一类来源各异、成分复杂却相对稳定的物质组成。一方面,CDOM是光学活性物质,是水体光学性质的主要决定因素[1];另一方面,CDOM富含碳、氮、磷等生源营养要素[2],通过迁移、转化等过程可直接参与元素的生物地球化学循环。因此CDOM具有十分重要的生态效应,对于海洋物质循环具有十分重要的意义。
海洋CDOM来源广泛,大致可以分为2种:外来源和原地源。前者由陆地径流、大气沉降等组成;后者以海洋浮游植物有机体降解、浮游细菌降解和海洋沉积物释放为主,其组成则主要分为类蛋白、类腐殖质和类色素3类[3]。
芦苇和海洋微藻是中国北方河口区优势植被和物种,其生长过程溶出和破碎细胞降解产生的有色溶解物质,是CDOM重要的生物源。为深入研究河口区CDOM的生物地球化学过程,本文浸取芦苇溶出液,分离微藻培养液,对其生产的CDOM的光谱吸收特性和荧光光谱特征进行了研究。
1.1 样品制备
实验室模拟河口区域芦苇和微藻溶出或分泌CDOM过程。芦苇在自然陈化过程中不断溶出CDOM,而微藻细胞新陈代谢速率快,所以二者的处理方法不同,具体制备过程如下。
1.1.1 芦苇CDOM样品制备 芦苇采自盘锦市羊圈子苇场(121°48′12.48″E, 41°9′50.60″N),时间为2015年7月。取芦苇茎和叶各8 g,洗净表面后,分别以500 mL超纯水(电阻率=18.2 MΩ·cm)浸泡,室温(22±2) ℃下避光放置。每天固定时间采集浸出液50 mL,持续4 d;后取适量茎、叶残渣用研钵磨碎,以超吹水稀释定容至50 mL,此为研磨液。浸出液与研磨液经Whatman GF/F膜(450 ℃灼烧4 h)过滤,储存于棕色样品瓶(450 ℃灼烧4 h)冷冻保存。
1.1.2 海洋微藻CDOM样品制备 实验所用微小原甲藻(Prorocentrumminimum)、多形微眼藻(Minutocelluspolymorphus)和马氏骨条藻(Skeletonemamarino)由藻种分离采集而得。微藻培养体系为灭菌海水(0.45 μm醋酸纤维膜过滤),按f/2配方添加营养盐,光照/黑暗周期为12 h/12 h,培养温度为(22±2) ℃。
微藻培养至指数增长期,各取30 mL藻液以3 000 r/min(飞鸽TDL-5-A型)转速离心10 min,采集上清液,称为“培养液”。残渣以30 mL TE缓冲液(Tris-EDTA buffer, pH=8.0)浸泡,采集浸出液,称为“TE浸出液”。培养液与TE浸出液经Whatman GF/F膜(450 ℃灼烧4 h)过滤,储存于棕色样品瓶(450 ℃灼烧4 h)冷冻保存。
采用血球计数板对微藻细胞密度进行计数分析,微小原甲藻、多形微眼藻和马氏骨条藻分别为1.20×105、5.76×105和6.32×105个/mL。
1.2 吸收光谱分析
采用UV-2550紫外可见分光光度计,以超纯水(电阻率=18.2 MΩ·cm)为参比,用1 cm石英比色皿在190~800 nm 范围内对水样进行扫描,间隔1 nm。CDOM的吸收系数按式(1)进行换算:
a(λ)=2.303/L×[A(λ)-A(700)]。
(1)
式中:a(λ)是波长λ处的光吸收系数(m-1);A(λ)是波长λ处的吸光度;A(700)用于校正仪器噪声和散射等影响;L是光程路径(m)。芦苇浸出液与研磨液、海洋微藻培养液、TE浸出液分别以超纯水、原海水培养液、TE缓冲液为空白校正。
250和365 nm波长处吸收系数的比值M能够较好地表征CDOM分子量的大小。因为大分子CDOM在长波段的吸收更强,所以M值越小对应的分子量则越大[4-5]。
特定波长范围的光谱斜率Sg值一定程度上也可以反映CDOM的分子组成。本文样品在250~400 nm范围内吸光度差异最显著,在该范围内按式(2)对Sg值进行非线性拟合[6]:
a(λ)=a(355)e-Sg(λ-355)+K。
(2)
式中:a(λ)是波长λ处的光吸收系数(m-1);a(355)是参考波长355 nm处的光吸收系数(m-1);Sg为光谱斜率的经验值(nm-1);K为背景参数,表征颗粒物质散射或仪器噪声引起的误差。
1.3 荧光光谱分析
采用日立F-4600荧光分光光度计,光源为450 W氙弧灯,PMT电压为700 V,激发波长200~450 nm,间隔2 nm,发射波长240~680 nm,间隔5 nm。狭缝宽度均为5 nm,扫描速度为12 000 nm/min。测量过程中每隔10个样品测一次Milli-Q水,根据其拉曼光谱350 nm处强度监控仪器稳定性。
以超纯水(电阻率=18.2 MΩ·cm)在激发波长350 nm处的拉曼峰面积,对荧光强度数据进行归一化处理,数据以拉曼单位(R.U.)表示。其中海洋微藻培养液、TE浸出液分别以原海水培养液、TE缓冲液为空白校正。
采用Delaunay 三角形内插值法[7]扣除拉曼散射和瑞利散射影响后,将预处理的数据导入Matlab,运用DOMFluor工具箱对三维荧光数据矩阵进行平行因子分析(parallel factor analysis, PARAFAC)。
2.1 芦苇CDOM的吸收和荧光光谱特征
2.1.1 芦苇CDOM的吸收光谱特征 芦苇茎、叶不同时间浸出液和研磨液的吸光度随波长缩短呈指数增长(见图1),在小于400 nm波段增长趋势尤其显著。茎、叶CDOM在浸出液中的曲线形状差异较大,茎在250~275 nm处有一肩峰,叶在300~325和250~275 nm处均有一肩峰,这与Warnock等的研究基本一致[8-9]。肩峰的差异说明茎、叶浸出液CDOM的物质组成存在差异。
(黑线—第1天;红线—第2天;蓝线—第3天;绿线—第4天;黄线—研磨液。Black line-1st day; Red line-2nd day; Blue line-3rd day; Green line-4th day; Yellow line-Grinding fluids.)
图1 芦苇茎、叶浸出液和研磨液吸光度随波长变化曲线
Fig.1 Absorbance curves of extractions from reed stem and leaf
浸出液和研磨液在355 nm波长处的吸收系数a(355)可用来表征CDOM浓度(见图2)。从时间跨度分析,茎、叶CDOM的a(355)均随浸泡时间延长而减小,说明浸出液中的CDOM浓度随时间降低,CDOM产生量不断降低或不断降解。从茎与叶的差异分析,叶CDOM的特征值a(355)约为茎的2~4倍,说明叶CDOM浓度大于茎。此外,叶CDOM的下降速率(11.55 m-1/d)约是茎(3.01 m-1/d)的4倍,说明茎CDOM的降解速率远低于叶。
M值和Sg值可作为CDOM分子量的表征参数,即M值或Sg值越大,CDOM分子量越小,同时二者均
在一定程度上反应了CDOM的结构特征。以M值为横坐标,Sg值为纵坐标,绘制Sg值随M值变化曲线(见图3),对其进行非线性拟合,结果显示M值与Sg值之间呈显著对数型正相关关系(r=0.999,P<0.01)。说明M值和Sg值在表征CDOM分子量和结构特征上有一致性。
与浸出液相比,研磨液CDOM的M值与Sg值均小于浸出液,说明细胞内物质分子量大于胞外溶出物质。从时间跨度角度,随浸泡时间延长,芦苇茎、叶浸出液CDOM的M值与Sg值均呈下降趋势,说明芦苇CDOM在浸泡过程中先溶出了分子量较小物质,然后溶出分子量较大物质。芦苇茎CDOM的M值与Sg值均大于叶,说明茎CDOM的分子量小于叶。
2.1.2 芦苇CDOM的荧光光谱特征 采用PARAFAC方法解析芦苇CDOM的荧光信号,共识别出3种荧光组分(见表1),分别为C1(220(274) nm/330 nm)、C2(226 nm/305 nm)和 C3(220(312) nm/440 nm)。
组分C1(220(274) nm/330 nm)和C2(226 nm/305 nm),分别与标准色氨酸和标准酪氨酸低激发波长处的的荧光峰位置基本一致,分别对应其类色氨酸和类酪氨酸的荧光特性[10-11]。组分C3(220(312) nm/440 nm)与在淡水和海水水体中识别出的类腐殖质荧光组分相类似,因而将C3归于类腐殖质荧光组分。3种组分在相关文献中均已有广泛报道(见表1)。
芦苇CDOM荧光峰的水平分布情况大致相同(见图5),但荧光强度存在差异(见图6)。总体而言,组分C2的荧光信号最强,平均贡献率为51.11%;C1次之,平均贡献率为40.18%;C3最弱,平均贡献率为8.71%。类蛋白组分的荧光强度贡献率远远高于类腐殖质,说明芦苇CDOM组分溶出以类蛋白成分为主。
芦苇叶浸出液和研磨液的吸收系数a(355)高于茎(见图2),但茎CDOM各组分的荧光强度均强于叶CDOM(见图5),说明茎分泌物质的荧光性要强于叶。这与茎、叶的具体物质组成有关,一般说来共轭性越强的物质荧光性越强[18]。M值和Sg值不仅表征CDOM组分分子量的大小,而且与其结构相关,芦苇茎的M值和Sg值约是叶的2~3倍,说明芦苇茎的CDOM组分共轭性更强,富里酸含量更高。
2.2 海洋微藻CDOM的吸收和荧光光谱特征
2.2.1 海洋微藻CDOM的吸收光谱特征 3种海洋微藻CDOM的吸光度随波长缩短而呈指数增长(见图7),在小于250 nm波段范围内增长趋势尤其显著。海洋微藻CDOM吸光度与波长的指数关系,与CDOM的组成和结构性质相关。低波长波段以类蛋白物质吸收为主,对海洋微藻而言,不仅含量高,其摩尔吸收系数更高;高波长波段以类腐殖酸物质吸收为主,对处于指数生长期的海洋微藻,其含量低,而且摩尔吸收系数低[19]。
对3种海洋微藻的单位藻细胞吸收系数作比较(见图8),结果显示微小原甲藻的吸收系数是多形微眼藻和马氏骨条藻的8~16倍。图7显示,3种微藻CDOM组成相似,说明单位微小原甲藻细胞生产的CDOM含量高于另外2种微藻。
以M值为横坐标,Sg值为纵坐标,绘制Sg值随M值变化曲线(见图9),对其进行非线性拟合,结果显示M值与Sg值之间同样呈对数型正相关(r=0.800,P<0.01)。芦苇与海洋微藻的Sg值与M值之间都呈现对数正相关关系,因此指征其CDOM分子量和结构特征的参数中,Sg值与M值是一致的。但是在实际应用中因Sg计算可以校正基线漂移,而被优先用于指征CDOM平均分子质量的相对大小[20-21]。
多形微眼藻和马氏骨条藻培养液中CDOM的M值和Sg值均低于浸出液(见图10),说明培养液中CDOM的分子量要大于浸出液,表明微藻细胞表面物质在脱离细胞后生成了分子量更大的物质;而微小原甲藻上清液CDOM的M值与Sg值均高于浸出液CDOM,说明上清液CDOM的分子量要小于浸出液,暗示微藻细胞表面物质降解生成了分子量更小的物质。存在这种差异的原因可能是甲藻与硅藻生理习性与分泌物质组成的不同[22]。
2.2.2 海洋微藻CDOM的荧光光谱特征 采用PARAFAC方法解析海洋微藻培养液和TE浸出液CDOM荧光信号,共识别出3种组分,其中培养液中检出全部3种组分,TE浸出液中仅检出C1和C3 2种组分(见表2)。C1峰与低、高激发波长处的类色氨酸荧光峰一致,C3峰与类酪氨酸荧光峰一致;C2峰为类腐殖质荧光峰。
注:(1)为培养液CDOM;(2)为TE浸出液CDOM。(1):Incubation solution CDOM;(2):TE extration CDOM。
海洋微藻培养液与TE浸出液CDOM的荧光峰水平分布情况存在很大差异(见图11),培养液CDOM的荧光强度也远远低于浸出液(见图12)。3种组分相比,培养液中组分C1的荧光强度最强,平均贡献率为51.43%;C2次之,平均贡献率为29.31%;C3最弱,平均贡献率为19.26%。组分C1表征的类色氨酸荧光强度高于其它组分,说明类色氨酸是培养液CDOM的主要荧光控制基团。浸出液中组分C1的荧光强度略强于C3,平均贡献率分别为58.95%和41.05%,说明附着在微藻细胞表面的类色氨酸物质的含量要高于类酪氨酸物质。
3种海洋微藻的荧光峰的位置和形状大致相同,但单位藻荧光强度存在差异。微小原甲藻培养液和浸出液CDOM的单位藻荧光强度是多形微眼藻和马氏骨条藻的2~5倍,荧光性明显强于另外两种海洋微藻。
2.3 芦苇和海洋微藻吸收和荧光光谱特征比较
2.3.1 吸收光谱特征 芦苇和海洋微藻CDOM的吸光度均随波长缩短呈指数增长,但具体吸收特性存在差异。芦苇和海洋微藻不同方式提取的CDOM的M值与Sg值之间均有很好的正相关关系,Sg值随M值增大呈对数增长趋势。其中海洋微藻培养液和TE浸出液CDOM的增长速率(0.064 nm-1)是芦苇浸出液和提取液CDOM(0.008 nm-1)的8倍,说明海洋微藻CDOM的Sg值对M值更灵敏。
2.3.2 荧光光谱特征 采用PARAFAC方法对CDOM样品进行解析,共识别出3种荧光组分:类色氨酸、类酪氨酸和类腐殖质。
类色氨酸组分在芦苇、海洋微藻培养液和TE浸出液CDOM中均有检出,荧光峰位置分别为220(274) nm/330 nm、230(278) nm/340 nm和226(276) nm/330 nm,这一组分在所有CDOM样品中均有较强的荧光贡献率,变化范围是40.18%~58.95%。该组分在海洋微藻CDOM中的荧光峰位置相对芦苇CDOM发生了转移,说明单位物质量芦苇CDOM组分的吸光系数和丰度高于海洋微藻。海洋微藻CDOM类色氨酸组分的来源是细胞衰老和死亡的破碎裂解[23],因此推测本文中该组分来源于芦苇和微藻细胞破碎裂解的有机质。
类酪氨酸组分在芦苇、海洋微藻培养液和TE浸出液CDOM中均有检出,荧光峰位置分别为226 nm/305 nm、228 nm/290 nm和224 nm/300 nm。类色氨酸与类酪氨酸同属类蛋白组分,其中类酪氨酸荧光与新生产物质有关,类色氨酸荧光与降解物质有关[15]。芦苇和海洋微藻CDOM的类酪氨酸荧光峰相近,说明二者新生产的类酪氨酸是一致的,来源于芦苇和海洋微藻细胞新溶出或分泌的有机质。芦苇和海洋微藻CDOM的类色氨酸荧光峰位置存在差异,可能其不同的降解方式或过程导致了这一差异,具体机制有待进一步研究。
类腐殖质组分在芦苇和海洋微藻培养液CDOM中有检出,荧光峰位置分别为220(312) nm/440 nm和254(322) nm/440 nm。该组分在微藻CDOM中的荧光峰位置相对芦苇CDOM发生了红移。类蛋白荧光和类腐殖质荧光分别代表新生和老化的溶解有机物[15]。芦苇和海洋微藻CDOM的高发射波长类腐殖质的荧光峰位置存在差异,可能由溶解有机物不同的老化机制导致。
(1)芦苇和海洋微藻CDOM的吸光度均随波长缩短而呈指数增长,Sg值与M值之间呈对数型正相关。
(2)芦苇CDOM共鉴别出3个荧光组分:类色氨酸C1(220(274) nm/330 nm)、类酪氨酸C2(226 nm/305 nm)和类腐殖质 C3(220(312) nm/440 nm)。
(3)海洋微藻CDOM共鉴别出3个荧光组分:类色氨酸C1(230(278) nm/340 nm和226(276) nm/330 nm)、类腐殖质C2(254(322) nm/440 nm)和类酪氨酸C3(228 nm/290 nm和224 nm/300 nm)。其中培养液中检出全部组分;TE浸出液中检出组分C1和C3。
(4)来源于芦苇和海洋微藻新溶出或分泌的类酪氨酸组分,荧光特性一致;来源于细胞分泌物质降解或细胞破碎裂解的类色氨酸和类腐殖质组分,荧光特征存在差异,适于区分和示踪河口区滨海来源和海洋生产CDOM。
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责任编辑 庞 旻
Absorption and Fluorescence Spectra Characterization of Chromophoric Dissolved Organic Matter from Reeds and Marine Microalgae
WEI Lai1, ZOU Li1,2, YANG Yang1, REN Qian-Qian1, JIAN Hui-Min3
(1.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 2.The Key Lab of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China; 3.The Key Lab of Marine Chemistry Theory and Technology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)
Chromophoric Dissolved Organic Matter (CDOM) is an important part of ocean carbon cycle. Sources, composition and characterization of CDOM is of great significance to reveal the complex estuarine mixing process. To address this issue, detailed absorption and fluorescence measurements have been acquired for CDOM samples collected from reeds and marine microalgae. Results show that absorption by CDOM increases with decreased wavelength and the value of Sg is logarithmically related to the value of M by CDOM. Analysis of CDOM-EEM spectra with PARAFAC model identifies 3 kinds of fluorescence components: tryptophan-like, tyrosine-like and humic-like. Tyrosine-like components derived from new dissolution or secretion of organic matter from reeds and marine microalgae have basically similar structure; Tryptophan-like components derived from decomposing products form burst cells between reeds and marine microalgae exist some structure differences; Humic-like components are derived from decomposing products of dissolution materials and products of burst cells.
CDOM; reeds; marine microalgae; absorption spectra; fluorescence characterization
国家水体污染控制与治理科技重大专项(2013ZX07202-007);国家自然科学基金项目(41176064)资助 Supported by National Water Pollution Control and Treatment Science and Technology Major Project (2013ZX07202-007); Natural Science Foundation of China (41176064)
2016-06-08;
2016-07-23
魏 莱(1994-),女,硕士生。E-mail: weilai94@sina.cn
❋❋ 通讯作者:E-mail: zouli@ouc.edu.cn
Q945;X171
A
1672-5174(2017)06-025-09
10.16441/j.cnki.hdxb.20160216
魏莱, 邹立, 杨阳, 等. 芦苇和海洋微藻有色溶解有机物的吸收和荧光光谱特征分析[J].中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(6): 25-33.
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